NB : Les renvois aux figures et tableaux font ici référence aux numéros de l’article présenté dans le
paragraphe 2.
Dans un premier temps, nous avons caractérisé par différentes techniques l’expression ainsi que la localisation de l’ANXA1 dans différentes lignées cellulaires humaines de mélanome (Figure 1, Tableau 2). Nous avons pour cela choisi la lignée SK-MEL-3 pour laquelle le niveau protéique d’ANXA1 avait été décrit précédemment par notre équipe [196], [202]. Nous avons également étudié deux nouvelles lignées humaines : SK-MEL-28 et A375-MA2. Cette étude a été plus largement présentée dans le paragraphe 3.1 de la partie 1. Cette étude de caractérisation nous a permis de sélectionner les lignées SK-MEL-28 et A375-MA2 pour les analyses de migration puisqu’elles expriment l’ANXA1 sous ses différentes formes (cytosolique, membranaire, sécrétée, clivée).
Dans un second temps, nous nous sommes intéressés au rôle de l’ANXA1 tumorale dans la prolifération et la migration cellulaire (Figure 2). Pour cela, les cellules ont été transfectées avec un ARN interférent dirigé contre l’ANXA1 (siANXA1) permettant de diminuer le niveau protéique de cette dernière. Nous avons ainsi montré que la diminution du niveau de l’ANXA1 limite la prolifération cellulaire des lignées SK-MEL-28 et A375-MA2. En revanche, elle permet seulement de diminuer les capacités migratoires de la lignée SK-MEL-28. Nous avons également évalué l’influence d’un apport exogène de l’ANXA1 sur la migration cellulaire en utilisant un peptide représentant une partie active du domaine Nter de la protéine (Ac2-26). Contrairement à la transfection avec le siANXA1, le peptide n’influence pas la prolifération cellulaire mais stimule la migration des cellules A375-MA2 sans modifier celle des SK-MEL-28.
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86 Nous nous sommes par la suite focalisés sur l’analyse de l’ANXA1 stromale en utilisant un modèle de souris C57Bl6/J invalidées (KO) pour l’Anxa1 (Figure 3). Ces animaux, ainsi que les souris sauvages (WT) correspondantes, ont été injectés en sous-cutané avec des cellules murines de mélanome B16Bl6 qui expriment l’ANXA1. Nous avons choisi ce modèle syngénique afin d’inclure dans l’étude la composante immunitaire. Nous avons ainsi pu démontrer que les tumeurs développées chez les souris KO ont une croissance ralentie et développent moins de métastases pulmonaires que chez les souris WT (Figure 3). Des analyses histologiques ont également révélé une prolifération ainsi qu’une vascularisation plus faible au niveau des tumeurs des souris KO par rapport à celles des souris WT (Figure 4). L’étude de différents marqueurs de cellules immunitaires réalisée par RT-qPCR a mis en évidence un afflux lymphocytaire plus abondant chez les tumeurs développées en absence d’ANXA1 environnante. Cependant, on observe à la fois une augmentation des cellules immunitaires cytotoxiques (LT CD8+ et NK) et pro-tumorales (LTreg) (Figure 5).
1.3- Discussion
L’ANXA1 présente un grand intérêt en tant que biomarqueur en oncologie. Cependant, son rôle exact au sein des mécanismes menant au développement et à la dissémination tumorale reste peu clair, voir controversé. Cette étude a donc visé à mieux comprendre le rôle de l’ANXA1 tumorale et non tumorale dans la progression du mélanome. Nos données révèlent que la transfection des cellules SK-MEL-28 et A375-MA2 avec le siANXA1 diminue leur prolifération, mais les effets sur la migration sont dépendants du type cellulaire. En effet le siANXA1 limite la migration des cellules SK-MEL-28 tandis que le peptide Ac2-26 stimule celle des cellules A375-MA2. Cette différence peut s’expliquer, entre autres, par des capacités migratoires plus élevées au niveau des cellules SK-MEL-28. Plusieurs études ont mis en évidence le rôle stimulateur de l’ANXA1 sur la migration cellulaire dans différentes pathologies cancéreuses comme par exemple le cancer du foie [104] ou encore le cancer du sein [161], [169]. En ce qui concerne la prolifération, des résultats plus hétérogènes ont été obtenus. Par exemple, l’ANXA1 stimule la prolifération des cellules cancéreuses de poumon [119] et de l’œsophage [118] mais elle est associée à des effets antiprolifératifs dans le cancer de l’estomac [134] et du sein [166], [167]. Dans le cas du mélanome, notre étude démontre le rôle stimulateur de l’ANXA1 sur la prolifération.
L’analyse de l’ANXA1 stromale a été plus informative. En effet, nos données ont montré pour la première fois dans le mélanome que l’absence d’ANXA1 chez l’hôte limite à la fois le développement
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87 et la dissémination tumorale. Ceci peut en partie s’expliquer par une prolifération et une vascularisation moins importante ainsi qu’un afflux lymphocytaire augmenté au niveau des tumeurs des souris KO, limitant ainsi le développement tumoral et la formation des métastases. En 2009, Yi et ses collaborateurs ont également montré que les tumeurs de mélanome développées chez des souris KO pour l’Anxa1 sont plus petites et moins vascularisées que celles des souris WT [246]. Cependant leur modèle d’étude ne leur avait pas permis d’étudier la formation des métastases. De plus, les vaisseaux tumoraux étant plus perméables que les vaisseaux normaux, il est probable que l’afflux de lymphocytes (à la fois pro- et anti-tumoraux) au niveau des tumeurs des souris KO, soit du à une perméabilité exacerbée en absence d’ANXA1 au niveau des cellules endothéliales. Cette hypothèse est soutenue par une étude montrant que l’ANXA1 est capable de réguler la perméabilité paracellulaire des cellules endothéliales du cerveau en modulant des protéines jonctionnelles comme l’occludine et la VE-Cadhérine [278]. Comme pour l’ANXA1 tumorale, l’implication de l’ANXA1 stromale dans la dissémination tumorale a été montrée dans d’autres types de cancers grâce à l’utilisation de souris invalidées. C’est par exemple le cas du cancer du poumon [246] et du sein [174], [247]. De façon générale, ces données ainsi que nos résultats s’accordent à démontrer que l’ANXA1 des cellules stromales est capable de moduler à la fois le développement et la dissémination tumorale.
1.4- Conclusion
L’importance de l’ANXA1 stromale dans le développement tumoral et la formation des métastases dans le mélanome, probablement via la modulation de l’angiogenèse, ressort clairement de ces travaux. Nos données soutiennent donc l’intérêt de l’étude du rôle de l’ANXA1 dans différents modèles de mélanome ainsi que son ciblage potentiel dans le cadre d’approches thérapeutiques.
NB : Sans l’épidémie de la COVID-19, cette étude aurait dû être complétée par une analyse in vivo
supplémentaire. Cette dernière devait nous permettre d’étudier le rôle de l’ANXA1 tumorale dans la progression du mélanome en utilisant le même modèle d’étude que pour l’ANXA1 stromale, soit l’injection sous-cutanée de cellules B16Bl6 à des souris C57Bl6/J WT et KO. Nous avions en effet pour projet d’injecter des cellules sauvages et des cellules invalidées pour l’Anxa1 (KO) grâce à la technique CRISPR/Cas9. Nous avions sous-traité la génération des cellules KO à une société portugaise qui a cessé son activité de service afin de s’impliquer dans la crise sanitaire. Les projets ont donc pris énormément de retard ne permettant pas d’inclure cette expérience dans la thèse ni dans l’article.
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