Gene Amplicon (bp) Forward primer Reverse primer
ZBTB16 110 AGACGTACCTCTACCTGTGCTATGTGT TGTCATAGTCCTTCCTTCATCTCACT
FKBP5 120 CCGGAGAACCAAACGGAAA TGAATGCCACATCTCTGCAGT
SCNN1A 120 CTGCACCTTTGGCATGATGTA TTCCGGGTACCTGTAGGGATT
PER1 80 CGGATACCCCCTGACAAGAG GCAGCCCTTTCATCCACATC
NFKBIA 110 CCTTCAGATGCTGCCAGAGAGT GGCCTCCAAACACACAGTCA
TPRG1 120 CCGAATCAACTCTTTACCCCAAT TCTCAGCTACGTGACCTTTCAAGT
PTPN1 85 AAAGACTGCCCCATCAAGGA CTTCAGTGTCTTGACTCATGCTTTC
NFATC2 110 AGCTGTTGGCTGACCAGAATAAA GGCCAATCAGAATGCTGTGA
FAM65B 120 TTTCCTGAACACCTCTGATTTTGA ACCGACCTGTAACTGTGTTTCTCA
ERGIC1 80 GCAGCAGCGGTAGAGACTTGA GGAACGAGGAGAAGAGAGGAAGA
LINC00963 130 CACGATGCCCTTTGACTTCAG ATGAAGAGGCAGCAGCAGATG
ZMYND8 80 CACAGCGATTCGGAGGATTC CCTCTGTGTCTTCTGGCTCGTT
SERPINE1 110 ACTTTTCAGAGGTGGAGAG AGTTGCTGATCATACCTTTT
18S 70 GTGCATGGCCGTTCTTAGTTG CATGCCAGAGTCTCGTTCGTT
89
B. Données complémentaires et autres éléments de discussion
Dans la première partie de mon travail de thèse, grâce à l’approche de ChIP-Seq appliquée au MR dans les cellules rénales humaines HK-GFP-hMR, nous avons pu identifier 974 sites génomiques de liaison du complexe aldostérone-MR (MBS pour MR Binding Sites). Ceci correspond au premier cistrome décrit pour le MR, en particulier dans un modèle rénal et humain. Contrairement à l’idée communément admise d’une transrégulation de proximité, faite au niveau de la partie toute proximale du promoteur d’un gène (région 5’ flanquante le site d’initiation de la transcription (TSS) de ce gène), nous montrons que le MR se fixe majoritairement (>85% des MBS) dans des régions régulatrices à une distance de plus de 10 kbp du TSS du gène le plus proche, en 5’ ou en 3’. La recherche de motifs nucléotidiques au sein des MBS nous a permis d’identifier de novo un élément de réponse spécifique du MR, le MRE, mais aussi d’identifier d’autres motifs correspondant à d’autres facteurs de transcription. Ce dernier point suggère que le MR agit directement sur la transcription mais aussi indirectement, par ancrage (tethering) sur d’autres transrégulateurs. Enfin, nous avons caractérisé, plus en détail, les 15 premières cibles potentielles qui semblaient aussi les plus pertinentes. Nous avons notamment mis en évidence, pour la plupart des cibles, une corrélation positive entre recrutement du complexe aldostérone-MR sur un MBS et l’activation, à court ou à long-terme, de la transcription du gène associé. De façon intéressante, il semble que la corrélation entre le recrutement sur un MBS d’un gène et la transactivation de ce même gène ne soit pas toujours systématique. Par exemple, la transcription du gène LINC00963 n’est pas influencée par la fixation du MR sur un MBS localisé à 112 kbp en aval. Globalement, cette étude a permis de répondre à certaines de nos interrogations, mais en a surtout ouverte d’autres, et nous allons en discuter ci-après.
Comment établir le lien entre le recrutement du complexe aldostérone-MR sur un MBS et la transrégulation d’un gène en présence d’aldostérone ?
Dans notre étude, chaque MBS a d’abord été associé au gène dont le TSS était le plus proche. Pour 14 des 15 MBS, nous avons montré que le gène le plus proche du MBS était transactivé par le MR lié à l’aldostérone. Par contre, l’un des MBS identifiés avait pour plus proche TSS celui du gène LINC00963. Or, la transcription du gène LINC00963 n’est pas régulée par l’aldostérone, quelque soit la durée d’exposition à celle-ci. Le MBS en question se trouve dans une région génomique désertique, et LINC00963 se trouve à 112 kb en aval. Comme nous l’avons présenté dans l’article, la grande majorité (84%) des MBS se situent à plus de 10 kbp du TSS le plus proche,
90 et près de 40% se situent même à plus de 100 kbp du plus proche TSS, dans de vastes régions intergéniques. Notre première hypothèse est que le MBS en aval de LINC00963 (en 3’) pouvait rendre compte de la régulation transcriptionnelle du premier gène en son aval (3’) qui s’avère être le gène C9orf106, même si ce dernier est à une distance plus importante que LINC00963. Or, nous avons montré que ce gène n’est pas non plus régulé par l’aldostérone (Figures 16). L’hypothèse la plus vraisemblable est donc que ce MBS serait responsable d’une régulation à très grande distance (> 100 Kbp) d’un gène qui reste à identifier. Les techniques de type 3C ou ChIA-PET (voir plus loin) permettraient de prendre en compte la conformation tridimensionnelle complexe et les repliements chromatiniens qui facilitent des boucles d’interaction indirecte entre des séquences d’ADN très distantes.
Figure 16 : Activité transrégulatrice associée à un MBS localisé dans une région génomique désertique.
Le MBS est localisé à 112 kb en amont du gène LINC00963, et à 113 kb en amont du gène C9orf106. Aucun des deux gènes n’est transrégulé par l’aldostérone dans les cellules HK-GFP-hMR, quelque soit la durée du traitement (30 min, 4 h, 24 h).
Afin de mieux cerner le rôle de ce MBS, il faut revenir sur la définition d’un enhancer. Les enhancers sont de courtes séquences non codantes d’ADN, agissant en éléments de cis-régulation pour activer la transcription de gènes cibles. Leur action est spécifique du type cellulaire et du stade de développement. Les enhancers regroupent des motifs de recrutement de facteurs de transcription qui, une fois liés, vont interagirent avec des promoteurs cibles (Pennacchio et al., 2013). Nous pouvons faire l’hypothèse que le MBS compris entre LINC00963 et C9orf106 se trouverait dans un enhancer non-fonctionnel, et que le recrutement du complexe aldostérone-MR est un reliquat de l’histoire évolutive de ce locus. Pour tester cette hypothèse, l’étude de rapporteur d’enhancer, qui permet de tester l’activité d’un enhancer, pourrait être réalisée. Elle consiste à fusionner, dans un vecteur approprié, la séquence enhancer candidate à un promoteur minimal
91 (nécessaire pour permettre l’expression du rapporteur mais pas suffisant) placé en amont d'un gène rapporteur (GFP, LacZ, luciférase). Le vecteur est transfecté dans les cellules d’intérêt et l’expression du gène rapporteur est mesurée. Si le gène rapporteur est activé, c’est que la séquence candidate agit comme un enhancer (Inoue and Ahituv, 2015). Cette approche de rapporteur d’enhancer a été adaptée à l’ultra-haut-débit (MPRA pour Massively Parallel enhancer
Reporter Assay) où, grâce à des codes-barres spécifiques, tous les enhancers d’un génome peuvent être testés en parallèle. L’association du ChIP-Seq et du MPRA permet d’identifier l’ensemble des cibles génomiques d’un facteur de transcription et de déterminer si elles sont fonctionnelles sur le plan transcriptionnel.
Pour le cas du MBS compris entre LINC00963 et C9orf106, si nous faisons la contre-hypothèse que l’enhancer est fonctionnel, il faudrait encore déterminer quel gène il régule. Les enhancers ont été identifiés sur tout le génome, en amont et en aval de leur promoteur cible, dans des introns ou des régions intergéniques, et parfois jusqu’à 1 Mbp de leur cible. Il est important de noter que, comme dans le cas présent, leur cible n’est pas nécessairement le promoteur le plus proche. Quand l’enhancer se trouve à très grande distance du promoteur, une boucle de chromatine se forme et autorise les interactions entre les facteurs de transcription de l’enhancer et la machinerie transcriptionnelle sur le promoteur (Whalen et al., 2016). C’est cette hypothèse de régulation à longue distance que nous faisons pour le MBS compris entre LINC00963 et
C9orf106, et afin de la tester, nous pourrions réaliser une expérience de ChIA-PET (Chromatin Interaction Analysis by Paired-End Tag Sequencing). Cette approche permet d’identifier, de novo et dans tout le génome, l’ensemble des interactions chromatiniennes à longue-distance (Fullwood et al., 2009). Elle a notamment été utilisée sur les récepteurs des hormones thyroïdiennes (TRα et β, NR1A1 et NR3A2), dont l’activation par l’hormone T3 est indispensable à la métamorphose des amphibiens (Grimaldi et al., 2013; Buisine et al., 2015). Le ChIA-PET, en combinaison avec le ChIP-Seq, a permis de connaître les cibles génomiques des TR dans le Xenopus tropicalis, et d’associer ces cibles génomiques aux cibles transcriptionnelles, notamment par mise en place de boucle chromatinienne. Une fois le gène cible identifié, la régulation transcriptionnelle par le complexe aldostérone-MR doit encore être établie, comme nous l’avons fait dans l’article pour les 15 premiers MBS.
92 Quelles sont les limites de l’approche de ChIP-Seq auxquelles nous avons été confrontées ?
Le choix d’un modèle cellulaire humain s'est justifié par le fait de l’implémentation des génomes humains de référence dans l’ensemble des outils bioinformatiques d’analyse de ChIP-Seq. La première limite que l'on peut évoquer dans cette approche de ChIP-Seq est le choix du modèle cellulaire. Nous avons en effet utilisé une lignée cellulaire rénale surexprimant le MR, et sous la forme d'une fusion avec la GFP. Les cellules parentales HK (ou H5) expriment en effet un MR endogène (voir la figure supplémentaire de l’Article 1) mais les expériences de ChIP n'ont pas permis d’observer de recrutement du MR induit par l'aldostérone. Ce résultat est à mettre en relation avec le très faible niveau d’expression du MR endogène. Cette caractéristique de très faible niveau d'expression, si ce n'est de perte d'expression du MR, a très généralement été observée lors de l'établissement de lignées cellulaires rénales humaines, justifiant la stratégie de transfecter de façon stable le MR. Un autre biais pour lequel nous avons dû nous justifier lors de la publication de l’article, puis lors des présentations des travaux en congrès, est l’utilisation d’une protéine de fusion GFP-hMR. La présence de la GFP greffée au hMR, en plus d’être éloigné de la physiologie, pourrait perturber la reconnaissance par l’anticorps 39N des 18 acides aminés N-terminaux et ainsi diminuer le nombre de cibles immunoprécipitées au cours des expériences de ChIP. Pourtant, l’anticorps 39N a permis de reconnaître spécifiquement le MR dans de nombreuses approches et sur différents modèles (western blot (voir l’Article 2), immunocytochimie (Viengchareun et al., 2009), immunoprécipitation (Figure supplémentaire Article 1)), suggérant que la présence la GFP n'apporte pas de biais majeur.
L’approche de ChIP-Seq appliquée au MR dans les cellules rénales humaines HK-GFP-hMR a permis d’identifier un nombre important de nouvelles cibles génomiques du MR. Cependant, et de façon surprenante, le gène SGK1, qui est une cible bien caractérisée de la signalisation minéralocorticoïde (Pearce and Kleyman, 2007), n’a pas été identifié par cette approche de ChIP-Seq. Pourtant, nous avons validé le recrutement aldostérone-induit du MR sur le MRE présent dans le promoteur (-362 pb en amont) de ce gène (Lee et al., 2013), au cours d’expériences de ChIP qPCR effectuées dans les mêmes conditions que celles réalisées pour le séquençage (Figure 17). La visualisation des données de séquençage sur I’Integrative Genomics Viewer (Robinson et al., 2011; Thorvaldsdóttir et al., 2013), montre la présence de pics d’intensités équivalentes dans les conditions contrôle (Veh) et traitées par l’aldostérone (Aldo) (Figure 17). Cela suggère que le MR est fixé sur le promoteur de SGK1 en absence de ligand (liaison basale). De plus, lors de l’analyse bioinformatique des données de séquençage, nous avons fixé une limite
93 de découverte de faux positifs (FDR pour False Discovery Rate) à une P-value < 10-5, ce qui est stringent. Puisque l’identification des MBS s’est faite en comparant la différence de profondeurs des pics entre les conditions Veh et Aldo, il ne peut pas être exclu que certaines cibles physiologiquement pertinentes aient été omises.
Figure 17 : Recrutement aldostérone-induit du MR sur le promoteur du gène SGK1.
A, Les cellules HK-GFP-hMR ont été traitées 1 h par 100 nM d’aldostérone puis fixées au paraformaldéhyde. Après lyse cellulaire et sonication, les fragments de chromatine ont été immunoprécipités avec l’anticorps 39N (V et A), ou avec un IgG contrôle de Lapin (C). Enfin, l’ADN a été purifié et utilisé au cours de PCR quantitatives réalisées avec des amorces entourant le MRE présent dans le promoteur du gène SGK1. Les résultats sont exprimés en %input et représentent la moyenne ± écart-type de triplicats. * : P<0,05 vs V.
B, Visualisation des données de séquençage de l’input, de l’immunoprécipitat de H3K4me3, marque histonique de chromatine transcriptionnellement active, et des immunoprécipitats des conditions Aldostérone et Véhicule, alignées avec le logiciel IGV, au niveau de la région promotrice du gène SGK1. Les données proviennent du ChIP-seq réalisé sur les cellules HK-GFP-hMR (numéro d’accès GSE69777). L’alignement est fait sur le génome humain de référence GRCh37 (hg19).
94 Un autre biais peut être évoqué pour expliquer l’absence, ou la présence, de certaines cibles dans le cistrome du MR décrit ici. Il s’agit de la concentration de 100 nM d’aldostérone utilisée pour le traitement des cellules HK-GFP-hMR. Cette concentration est environ 200 fois supérieure à l’aldostéronémie moyenne à laquelle est exposé le néphron. Nous avions choisi de travailler avec cette concentration dans la mesure où le traitement des cellules HK-GFP-hMR par seulement 1 nM d’aldostérone ne permettait pas d’observer de recrutement du MR sur le promoteur de SCNN1A qui soit significativement différent du recrutement basal. Afin de pouvoir identifier de façon exhaustive les cibles du complexe aldostérone-MR, nous avons donc retenu la concentration supraphysiologique de 100 nM. Finalement, cette approche nous a permis d’avoir une vision exhaustive des cibles génomiques du MR dans le rein, mais elle est tout à fait indissociable de la validation in vitro et in vivo des cibles identifiées.
De façon surprenante, l’étude de la transrégulation des 15 MBS caractérisés n’a pas permis de mettre en évidence de gène réprimé par l’aldostérone. La transrépression de gènes par le MR avait été mis en évidence par des approches de transcriptomique, avec les glucocorticoïdes comme ligands, dans le système nerveux et dans les cardiomyocytes (Meijer et al., 2000; Latouche et al., 2010). Comme pour le GR, pour lequel les cistromes identifiés étaient corrélés à des gènes activés ou réprimés par les glucocorticoïdes (Pan et al., 2011 ; Polman et al., 2012), nous avons fait l’hypothèse que des gènes réprimés par le MR pouvaient être identifiés également. L’approche de RNA-Seq constitue incontestablement une stratégie pertinente pour identifier des gènes transréprimés par l’aldostérone. En effet, en séquençant l’ensemble des transcrits du MR sur un modèle approprié, cela permet d’obtenir une cartographie instantanée de l’effet de l’aldostérone à un instant donné. L’équipe du Dr Sachs a mis en évidence que le TR non-ligandé était recruté de façon basale sur la plupart des sites de liaison dans le cadre de la métamorphose (pattes et queue) chez le Xenopus (Sachs, 2015). Cette liaison basale du TR était associée à des effets transrépressifs. De façon surprenante, la T3 entraînait alors le détachement du TR des cibles génomiques, et la conversion des effets transrépressifs en transactivation. Nous avions aussi essayé d’identifier des MBS pour lesquels la stimulation par l’aldostérone inhiberait un recrutement basal et constitutif du MR. Avec le FDR que nous avions fixé (P<10-5), aucune cible ne ressortait significativement. Le RNA-Seq ici semble donc indispensable pour complémenter les informations du ChIP-Seq.
Si nous devions réaliser le RNA-Seq des cellules HK-GFP-hMR traitées par l’aldostérone, il nous faudrait au minimum reproduire les cinétiques de stimulation de 30 min, 4 h et 24 h. En effet,
95 nous montrons ici que le recrutement du MR est suivi d’effets transcriptionnels à court, moyen ou long terme, et il serait donc indispensable d’évaluer le transcriptome du complexe aldostérone-MR à différents temps. De façon similaire, nous savons que le recrutement des facteurs de transcription n’est pas figé mais dynamique (voir la partie III de l’introduction). Ainsi, il serait tout à fait intéressant de réaliser le séquençage des MBS après plusieurs durées d’exposition à l’aldostérone sur les cellules HK-GFP-hMR. Il est plus probable que le cistrome du MR, que nous décrivons ici pour un traitement d’une heure, varie au cours du temps, et soit composé de MBS liés précocement, et d’autres plus tardivement. Cela pourrait d’ailleurs permettre d’identifier certaines cibles connues et bien caractérisées qui n’ont pas été initialement retrouvées. En étudiant en parallèle les marques d’ouverture de la chromatine (par exemple, la triméthylation de la lysine 4 de l’histone H3), nous pourrions corréler la dynamique de liaison du MR à un MBS avec l’ouverture ou non du locus. Il a en effet été montré que les loci transcrit tardivement étaient localisés majoritairement dans des zones de chromatine fermées, qui nécessitaient le recrutement de partenaires tels que les histones déacétylases pour être accessibles (Zhu et al., 2012; Love et al., 2017).
Est-ce que les cibles du complexe aldostérone-MR identifiées dans les cellules HK-GFP-MR, une lignée rénale humaine, sont conservées dans d’autres espèces ?
L’identification de cibles communes à deux espèces renforcerait la pertinence de ces nouveaux acteurs potentiels de la signalisation minéralocorticoïde rénale, que ce soit dans la fonction de réabsorption de sodium ou dans d’autres fonctions physiologiques. A l'inverse, l'identification de cibles spécifiques à une espèce, permettrait soit d'éliminer des cibles non pertinentes ou des faux positifs. Il apparait donc que la confrontation du cistrome que nous avons caractérisé dans les cellules rénales humaines HK-GFP-hMR avec le cistrome d'une lignée rénale mais appartenant à une autre espèce comme la souris serait de tout premier intérêt.
Pour ces raisons, nous avons envisagé d’utiliser les cellules murines KC3AC1. Ces cellules immortalisées ont été établies au laboratoire à partir de microdissection de tubes collecteurs corticaux d’une souris transgénique P1.hMR-TAg (Teixeira et al., 2006). Ces cellules ont les caractéristiques de cellules principales qui expriment de façon endogène un MR fonctionnel et sensible à l’aldostérone. Elles sont le siège d’un transport ionique transépithélial, préalablement et expérimentalement validé (Viengchareun et al, 2009). Ce transport a été démontré en mesurant la résistance transépithéliale et le courant de court-circuit avec un voltmètre positionné de part et
96 d’autre d’un puits compartimenté, séparé par un filtre sur lequel poussent les cellules épithéliales polarisées (pour le protocole, voir (Viengchareun et al., 2009)). Avec les cellules KC3AC1, nous envisagions notamment d’utiliser la stratégie d’interférence de l’ARN, permettant d’inhiber spécifiquement l’expression d’une protéine, couplée à des mesures de courant transépithélial (selon le protocole décrit ci-avant). Cela aurait permis de caractériser le rôle de certaines cibles dans le transport ionique.
Enfin, la réalisation d’un ChIP-Seq à partir des cellules KC3AC1 devait permettre l’identification du premier cistrome du MR dans un modèle rénal où son expression du MR est endogène, par opposition aux systèmes de surexpression de protéines de fusion (Ueda et al., 2014 ; Le Billan et al., 2015). Nous avons cherché à développer l’approche de ChIP-Seq sur les cellules KC3AC1. Elles expriment les principaux gènes cibles de l’aldostérone participant à la régulation aldostérone-dépendante du transport de sodium (Sgk1, Gilz, Enac (Scnn1a), 11βHSD2 (Hsd11b2), etc…). J’ai mis au point les étapes critiques de ChIP sur les cellules rénales KC3AC1 (durée de la fixation intermoléculaire (greffage covalent des partenaires moléculaires) au paraformaldéhyde et durée de fragmentation de l’ADN par sonication) puis réalisé une expérience pilote après exposition des cellules à l’aldostérone ou au véhicule. L’immunoprécipitation du MR a été réalisée avec l’anticorps 39N. Puis, par PCR quantitative, j’ai observé l’enrichissement de deux cibles classiques dans le rein : Scnn1a et Sgk1. Comme on peut le voir sur la Figure 18, l’aldostérone induit, de façon significative, le recrutement du MR sur ces deux cibles dans les cellules KC3AC1. Cette expérience a été répliquée et nous avons fait séquencer les échantillons issus des différentes conditions par la plateforme Génomique de l’Institut de Biologie de l’ENS (IBENS, ENS Ulm, Paris). Malheureusement, la quantité très limitée de matériel immunoprécipité (quelques ng d’ADN) a rendu l’établissement des librairies de séquençage haut débit problématique. De plus, cette très faible quantité de matériel ne nous a donné qu'une très faible profondeur de lecture des résultats de séquençage. Par ailleurs, et plus grave encore, une erreur de traçabilité des échantillons (étiquetage par code-barres) a rendu impossible l’analyse bio-informatique fiable des données du séquençage.
En souhaitant répliquer ces expériences, et réaliser de nouveau le séquençage, nous nous sommes heurtés à l’épuisement de l’anticorps polyclonal du MR, 39N. Un autre anticorps, SY4649, avait été développé par notre laboratoire selon la même stratégie que 39N. Cet anticorps est dirigé contre le domaine AF-1 (résidus 1 à 167 N-terminaux) du MR humain, et nous l’avons utilisé extensivement pour les expériences présentées dans l’Article 3. Le domaine
97
Figure 18 : Recrutement aldostérone-induit du MR sur le promoteur des gènes Scnn1a et Sgk1 dans les cellules KC3AC1.
Les cellules KC3AC1 ont été traitées 1 h par 100 nM d’aldostérone puis fixées au paraformaldéhyde. Après lyse cellulaire et sonication, les fragments de chromatine ont été immunoprécipités avec l’anticorps 39N (V et A), ou avec un IgG contrôle de Lapin (C). Enfin, l’ADN a été purifié et utilisé au cours de PCR quantitatives réalisées avec des amorces entourant le MRE présent dans le promoteur des gènes Scnn1a et Sgk1. Les