Préparation de nanoparticules mixtes

L’auto-assemblage des chaînes de copolymères biséquencés DTPA(Gd3+_)PEO-b-PCL

sur le cisplatine dans l’eau a conduit, après 24 heures de réaction à 0 °C, à la formation de nanoparticules mixtes _{avec une charge en drogue inférieure à 0,5 wt%. Ce résultat n’est pas} surprenant étant donnée _{l’hydrophilie des complexes hydratés du cisplatine qui ne se laissent} donc pas _{emprisonner dans le cœur hydrophobe de PCL et n’ont aucune possibilité d’attache} au niveau de la couronne de PEO. Un essai de formulation de nanoparticules mixtes combinant les deux copolymères séquencés DTPA(Gd3+_{)PEO-b-PCL et PEO}

120-b-

poly[(carbonate-CO2PhF5)5–co–( -CL)6] introduits dans des proportions 1,5 pour 1 (mol:mol)

a également été réalisé, conduisant à la formation d’une population de nanoparticules hybrides

a priori bien définies, de taille moyenne 23,86 ± 2,013 nm, mais avec une charge en drogue et

en gadolinium inférieure à 1,2 wt% et 0,20 wt% respectivement.

5. Discussion

Les résultats préliminaires obtenus sur des formulations de nanoparticules réticulées sur le cisplatine à partir du copolymère PEO120-b-poly[(carbonate-CO2PhF5)5–co–( -CL)6] se

sont révélés insatisfaisants, avec une charge en drogue beaucoup trop faible et des particules difficilement caractérisables de par leur morphologie aléatoire. Des alternatives ont donc été proposées dans le but d’améliorer la réticulation du système copolymère sur le cisplatine. Ainsi, comme la complexation du cisplatine au copolymère repose sur la présence de groupements fonctionnels carboxylate le long des chaînes polycarbonate, une augmentation du nombre de ces fonctions chimiques devrait permettre d’augmenter la charge en drogue. L’auto-assemblage spontané dans l’eau des chaînes copolymère étant rendu possible par leurs propriétés amphiphiles, il pourrait être envisagé de s’affranchir du segment hydrophobe de PCL puisque le polycarbonate lui-même devient hydrophobe dès lors qu’il se conjugue au cisplatine, devenant alors susceptible de former le cœur de la nanoparticule. La synthèse d’un copolymère séquencé PEO5.000-b-PC2.000 a ainsi été envisagée. De manière analogue, une autre

possibilité permettant d’augmenter le nombre de groupements carboxylate consisterait à synthétiser un copolymère séquencé de masse molaire plus élevée tout en gardant la même HLB, à _{partir d’un poly(oxyde d’éthylène) méthyl éther de degré de polymérisation moyen} double de celui utilisé précédemment comme amorceur de la polymérisation par ouverture de cycle du carbonate-CO2PhF5 et de l’ -CL. En parallèle de ces copolymères séquencés, la

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synthèse d’un homopolycarbonate de masse molaire élevée pourrait permettre, après sa fonctionnalisation par des groupements carboxylate comme décrit précédemment, de davantage stabiliser la nanoparticule via un nombre accru de sites de réticulation avec le cisplatine (Engler et al. 2015). Une purification par ultrafiltration de la solution nanoparticulaire a également été envisagée, sans succès du fait de pertes considérables du produit. Le recours à un procédé de nanoprécipitation constituerait une autre alternative à l’obtention de nanoparticules présentant une charge en drogue plus élevée (Cajot, Riva, et al. 2011; Lepeltier et al. 2014).

Par ailleurs, des nanoparticules dédiées à l’imagerie ont été formulées avec succès à partir du copolymère biséquencé DTPA(Gd3+_{)PEO-b-PCL. Toutefois, la dissolution préalable}

du copolymère dans le DMF avant ajout de cinq équivalents en volume d’eau est nécessaire à l’obtention de nanoparticules bien définies. Bien que la formulation soit suivie d’une dialyse contre de l’eau distillée de six heures durant laquelle les traces résiduelles de DMF sont éliminées, le recours à un solvant organique toxique pour le développement d’un outil à visée biomédicale demeure discutable.

Les limitations rencontrées au cours de ces travaux préliminaires et formalisées à travers ce chapitre de préambule nous ont amenés à revenir sur la stratégie initiale du projet, basée _{sur l’utilisation de deux copolymères séquencés distincts, intéressants de par leurs} spécificités et propriétés _{à visée soit d’imagerie soit de thérapie. Les limites inhérentes à la} flexibilité souhaitée dans le procédé de formulation _{s’expliquent notamment par le fait que les} deux systèmes, _{étudiés indépendamment l’un de l’autre, sont très différents dans leur façon} même de s’auto-assembler en solution. En effet, les copolymères biséquencés DTPA(Gd3+_)PEO

120-b-PCL16 s’auto-assemblent spontanément dans l’eau pour former des

nanoparticules de par leurs propriétés amphiphiles. Le copolymère PEO120-b-poly[(carbonate-

spacer-COOH)5–co–( -CL)6], bien que capable d’un tel comportement en milieu acide, a été

conçu pour permettre une réticulation sur le cisplatine, en milieu neutre voire légèrement basique, qui devient un lien chimique structurant propre à la nanoparticule. Les liaisons de coordination avec le complexe de platine stabilisent ainsi la particule.

Par conséquent, le concept initial de ce projet a évolué vers l’élaboration d’un système finalement plus simple, sur la base d’un seul copolymère triséquencé amphiphile de DTPA(Gd3+_{)PEO-b-(PC-spacer-COOH)-b-PCL combinant des propriétés d’imagerie, de par}

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biais de fonctions carboxylate _{le long de la chaîne polycarbonate. L’auto-assemblage} spontané dans l’eau des chaînes copolymère permettrait ainsi l’obtention de nanoparticules mixtes stabilisées par des liaisons chimiques de coordination, outrepassant ainsi la limite de la concentration _{d’agrégation critique (CAC) rencontrée dans un contexte d’administration in}

vivodans l’organisme.

L’article qui suit, soumis au journal Biomaterials Science en mars 2018, présente ainsi la synthèse et la fonctionnalisation d’un nouveau copolymère triséquencé combinant des propriétés d’imagerie et la capacité de former une prodrogue macromoléculaire par réticulation sur le cisplatine. Un PEO-b-poly(carbonate-CO2PhF5)-b-PCL a été synthétisé par

polymérisation par ouverture de cycle successive du carbonate-CO2PhF5 à partir du

groupement hydroxyle terminal de l’α-acétal-PEO-OH, puis de l’ -CL. La conversion des groupements pentafluorophényle le long des chaînes polycarbonate par une réaction en deux étapes avec le 3-aminopropan-1-ol puis l’anhydride succinique a été réalisée comme détaillé dans le paragraphe 3.2.3. afin de les fonctionnaliser via des groupements carboxylate capable de réticuler avec le cisplatine. Le protocole de greffage du complexe de gadolinium en α du copolymère triséquencé a été adapté de la procédure décrite au paragraphe 3.1.5.. Sur la base des premières observations détaillées à travers ce chapitre et des limitations ainsi mises en évidence, nous avo_{ns décidé d’adapter certains paramètres du procédé de formulation} ultérieur afin d’optimiser l’obtention de nanoparticules polymère réticulées sur le cisplatine et leur caractérisation physicochimique. Ces éléments sont passés en revue dans le paragraphe suivant, de façon à _{poser le cadre d’étude de l’article constituant le chapitre 4 de ce manuscrit.} Afin d’éviter la présence dans le milieu de toute espèce potentiellement concurrente des fonctions carboxylate dans leur réticulation avec le cisplatine, une solution de soude à 0,1 M sera désormais utilisée dans la suite du projet pour augmenter le pH des mélanges réactionnels de formulation. La température du mélange réactionnel, maintenue au cours de ces essais préliminaires à 0 °C par un bain de glace, sera fixée dans la suite à 37 °C, dans l’optique de favoriser la réaction de coordination du platine aux fonctions carboxylate (Gryparis et al. 2007). Comme souligné précédemment, la balance hydrophile-lipophile du copolymère triséquencé dépend du pH puisque les fonctions acide carboxylique seront protonées à pH acide et exhiberont donc des propriétés plutôt lipophiles, tandis qu’elles seront déprotonées en milieu neutre à basique (pKaCOOH/COO- ≈ 4,9), rendant alors la chaîne

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prodrogues macromoléculaires puisque le cisplatine réticulé est inactivé jusqu’à être libéré dans le milieu intracellulaire où il retrouvera son intégrité. Différents paramètres expérimentaux ont été rapportés dans la littérature comme jouant un rôle clé dans le processus de formulation de nanoparticules polymère (Mai & Eisenberg 2012). La concentration du copolymère en solution, le ratio molaire entre cisplatine et fonctions carboxylate et la durée de la réaction de coordination _{constituent les principaux paramètres d’intérêt considérés dans la} suite de cette étude pour l’obtention de nanoparticules polymère réticulées sur le cisplatine. L’impact de ces variables sur la charge en drogue des nanoparticules, ainsi que sur leur taille et leur stabilité au cours du temps, sera étudié dans le but de déterminer les paramètres optimaux à la formulation de nanosystèmes hybrides adaptés au traitement locorégional du glioblastome. Chaque expérience sera considérée indépendante de la température, du pH et de la vitesse d’agitation, fixés à 37 °C, 7,4 et 240 rpm respectivement.

La caractérisation des nanoparticules passe nécessairement par une mesure de leur taille, élément fondamental notamment dans la perspective d’une future administration in

vivo. La taille et la distribution de tailles conditionnent en effet les interactions avec le vivant,

notamment les mécanismes de prise en charge intracellulaire ou à l’inverse d’élimination (Montes-Burgos et al. 2010). Toutefois, une telle caractérisation requiert une définition préalable du concept de taille. Comme nous _{l’avons évoqué précédemment dans le cas des} nanoparticules PEO-b-poly[(carbonate-spacer-COOH)_{–co–( -CL) réticulées sur le cisplatine,} la définition de taille dépend intrinsèquement de la géométrie de l’objet (sphérique, cylindrique, …). Il est donc nécessaire d’atteindre un consensus en définissant une dimension caractéristique de l’objet, accessible par l’expérience. Le rayon hydrodynamique, ou rayon équivalent d’une sphère de même comportement hydrodynamique que la particule analysée, est communément utilisé en granulométrie. Il se mesure par le recours à des techniques de diffusion dynamique de la lumière, sur la base de la théorie de Mie qui décrit la diffraction d’une onde électromagnétique par une particule sphérique en mouvement aléatoire dans un liquide. La technique conventionnelle de détermination de la taille moyenne et de la distribution de tailles d’une population repose sur le principe de diffusion dynamique de la lumière. La mesure est couramment réalisée sur un appareil de DLS. L’algorithme développé en interne par la société Malvern commercialisant ces instruments extrapole du faisceau de lumière diffracté reçu par les capteurs une distribution de taille de la population de nanoparticules. Alors que la théorie de Mie formalise la diffusion de la lumière aux petits

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angles, des mesures à angle nul dans les conditions expérimentales masqueraient les petites particules au profit des plus grosses, induisant ainsi un biais sur la distribution de tailles, non représentative de l’échantillon analysé. Par conséquent, les systèmes de DLS Malvern utilisés au laboratoire permettent une mesure de diffusion de la lumière soit à un angle de 12,8 °, avec un risque de perte de sensibilité pour la détection des petites particules, soit par rétrodiffusion à un angle de 173 °. Cette seconde configuration est généralement privilégiée puisqu’elle rend possible la visualisation des différentes classes granulométriques d’une population. Toutefois, une variabilité sur les mesures de tailles moyennes de certaines formulations préliminaires et un défaut de reproductibilité d’une expérience à l’autre ont engendré une remise en question de la fiabilité des mesures de tailles par DLS. En effet, la mise en place expérimentale de la mesure par rétrodiffusion à 173 ° ne respecte pas fondamentalement la théorie de Mie qui formalise la diffusion de la lumière aux petits angles. Il a ainsi été décidé de mettre en œuvre une méthode orthogonale à la DLS de façon à vérifier la qualité et la pertinence des résultats obtenus précédemment. Contrairement aux méthodes ensemblistes auxquelles appartient la DLS, une analyse individuelle du suivi du mouvement brownien des particules en solution a été réalisée par NTA. Le principe de fonctionnement du NTA est explicité par la Figure 3.16. Un faible volume (300 µL) _{d’une suspension de nanoparticules à une concentration comprise} entre 107 _{et 10}9 _{particules.mL}-1 _{est introduit dans une cellule dite de diffraction que traverse}

un faisceau laser à 405 nm. Le couplage d’un microscope à ce système permet de visualiser en temps réel la lumière diffractée par les nanoparticules en mouvement. Une caméra permet d’enregistrer le mouvement des nanoparticules dans un champ de vue déterminé d’approximativement 100 x 100 µm². L’analyse de ces acquisitions permet de suivre la trajectoire de chaque particule, simultanément, dans l’espace et dans le temps, image après image.

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Figure 3.16 : Principe de l'analyse du suivi individuel de particules (NTA) (adapté de la documentation technique de Malvern)

Le logiciel d’analyse associé à l’appareil considère comme une particule un élément diffractant de la lumière dont il est capable de suivre la trajectoire sur au moins cinq images consécutives. La loi de Stokes-Einstein, rappelée par l’équation (6), formalise le mouvement brownien dans l’espace d’une particule de forme sphérique en régime laminaire (Gallego- Urrea et al. 2011) :

= _{∗ 𝜋 ∗ 𝜗 ∗}∗ 𝑇

ℎ 𝑎 𝑖

où : représente le coefficient de diffusion de la particule, la constante de Boltzmann, _𝑇 la température absolue, _{𝜗 la viscosité du milieu et ℎ} le rayon hydrodynamique.

Si l’on considère un mouvement plan tel que celui des nanoparticules enregistré par la caméra, le déplacement quadratique moyen d’une particule dans un milieu donné est relié au coefficient de diffusion par l’équation (7) (Gallego-Urrea et al. 2011) :

̅̅̅ + ̅̅̅ = = ∗ ∗ 𝑎 𝑖

où : _{̅ et ̅ représentent les déplacements absolus de la particule dans la direction x et y} respectivement pendant un temps , et le _{libre parcours moyen, c’est-à-dire la distance entre} deux positions successives de la particule.

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L_{’équation (8), adaptée de la loi de Stokes-Einstein, permet de remonter de la vitesse} quadratique moyenne d’une particule à sa taille (Domingos et al. 2009; Filipe et al. 2010; Gallego-Urrea et al. 2011; Gross et al. 2016) :

,

̅̅̅̅̅̅̅̅̅ = _{∗ 𝜋 ∗ 𝜗 ∗}∗ ∗ 𝑇

ℎ 𝑎 𝑖

où : ̅̅̅̅̅̅̅̅̅ représente la vitesse quadratique moyenne de la particule. _,

Le NTA constitue une méthode d’analyse absolue puisqu’elle ne nécessite aucune calibration préalable de l’appareil ; le coefficient de diffusion des nanoparticules dans le milieu d’analyse est mesuré à partir de la température du liquide injecté et de la viscosité du milieu, conduisant à la détermination du rayon hydrodynamique équivalent de chaque particule, et finalement à une distribution de tailles de la population analysée (Montes-Burgos et al. 2010). _{Une telle analyse moyenne en nombre d’une population permet de s’affranchir} des risques de surestimation de la distribution en tailles associés à une analyse classique de DLS pour laquelle l’intensité de la lumière diffractée est proportionnelle au diamètre de la particule à la puissance six. Cette technique est par conséquent très sensible à la présence de grosses particules et ne rend pas fidèlement compte de la distribution réelle de tailles d’un échantillon lorsque celui-_{ci est complexe ou polydisperse comme c’est le cas de nombreux} échantillons biologiques (Filipe et al. 2010). _{A l’inverse, la capacité du NTA à mesurer} simultanément des tailles pondérées en nombre ainsi que l’intensité diffractée par les particules offre une excellente résolution pour l’étude de solutions particulaires hétérogènes, sans hypothèse préalable quant à la nature de la distribution (Boyd et al. 2011). En outre, l’analyse individuelle de chaque particule permet de remonter directement à la concentration globale en nombre de l’échantillon, ce qui apporte une information quantitative supplémentaire à la simple mesure de taille. Par conséquent, la caractérisation des nanoparticules polymère réticulées sur le cisplatine formulées par la suite sera réalisée par NTA.