Formulation de nanoparticules PEO-b-poly[(carbonate-CO 2 PhF 5 ) –co–(ε-CL)]

réticulées sur le cisplatine

Le copolymère séquencé PEO-b-poly[(carbonate-CO2PhF5)–co–( -CL)] a été

synthétisé et fonctionnalisé dans l’optique de permettre la réticulation des fonctions carboxylate pendant le long des motifs carbonate sur le cisplatine. Les essais de formulation ont été inspirés de la littérature (Ye et al. 2006; Huynh et al. 2012; Li et al. 2014; Duan et al. 2015).

4.2.1. Aquation du cisplatine

Pour exercer son activité anticancéreuse, le cisplatine doit préalablement être activé par aquation (Miller & House 1989; Kelland 2007). Ce phénomène, qui consiste en la substitution des ligands chlore par des molécules d’eau, advient naturellement en milieu intracellulaire du fait de la faible concentration en chlore par rapport au milieu extracellulaire. L’activation du cisplatine est nécessaire à une réticulation ultérieure sur les fonctions carboxylate du copolymère. Cette réaction d’aquation du cisplatine a été adaptée de la littérature (Ye et al. 2006; Huynh et al. 2012; Li et al. 2014; Duan et al. 2015). Le cisplatine (66,3 mg ; 0,221 mmol) a été pesé sous boîte à gants et partiellement solubilisé dans 22 mL d’eau ultrapure. Une solution aqueuse de nitrate d’argent à 0,06 M (7,37 mL ; 0,442 mmol ; 2 équivalents) a été ajoutée au cisplatine, et le mélange a été laissé sous agitation vigoureuse, à l’abri de la lumière et à température ambiante, durant une nuit. Un précipité blanc de chlorure d’argent est progressivement apparu, qui a été éliminé à l’issue de la réaction par centrifugation de la solution à 10.000 rpm pendant 20 minutes. Le surnageant a été filtré sur 0,22 µm puis la quantité de platine a été dosée par ICP-MS.

Efficacité de la réaction d’activation du cisplatine : 93 %.

4.2.2. Réaction de coordination du cisplatine aux fonctions carboxylate

La réaction de coordination du cisplatine aux fonctions carboxylate le long des motifs carbonate du copolymère séquencé a été adaptée de la littérature (Ye et al. 2006; Huynh et al. 2012; Li et al. 2014; Duan et al. 2015). Le copolymère PEO120-b-poly[(carbonate-CO2PhF5)5–

co_{–( -CL)}6] (86,0 mg ; 0,0569 mmol de motifs carbonate-spacer-COOH) a été dissous dans

1,4 mL d’eau mQ et laissé sous agitation pendant 30 minutes à température ambiante. Du carbonate de sodium (17,7 mg ; 0,167 mmol ; 2,9 équivalents) a été ajouté de façon à déprotoner les fonctions acide carboxylique et ainsi permettre la réticulation sur le cisplatine.

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La solution de copolymère a été laissée sous agitation 30 minutes supplémentaires. La solution de cisplatine (20 mL ; 0,150 mmol ; 2,6 équivalents) préparée comme décrit dans le paragraphe précédent a alors été ajoutée goutte-à-goutte au milieu du vortex imposé à la solution de copolymère. Le mélange a été laissé sous agitation vigoureuse pendant 24 heures dans un bain de glace. A l’issue de la réaction, la solution a été dialysée contre de l’eau mQ (seuil de coupure : 1 kD) pendant 24 heures de façon à élim_{iner l’excès de cisplatine n’ayant} pas été complexé avec les groupements fonctionnels carboxylate du copolymère. Le bain de dialyse a été régulièrement changé et remplacé par de l’eau mQ fraîchement tirée au cours de la dialyse. La quantité de platine ainsi éliminée a été suivie par ICP-MS au cours du temps de façon à s’assurer de la pureté de la suspension de nanoparticules récupérée à l’issue de la dialyse, mais également dans un souci de gestion des déchets toxiques. La quantité de platine présente dans le dialysat à l’issue de cette étape de purification a été dosée par ICP-MS. Après lyophilisation, une masse précise du produit obtenu a été remise en solution dans 1 mL d’eau et la concentration en platine de cette suspension a été à nouveau dosée par ICP-MS de façon à déterminer la charge en drogue (ou DLC pour “Drug-Loading Content”) de chaque formulation. Notons que la drogue ici considérée est le complexe (NH3)2Pt(II), forme active

du cisplatine capable de réticule_{r sur l’ADN. Le DLC est défini comme le pourcentage en} poids de la forme active du cisplatine rapporté à la masse du conjugué copolymère-Pt(II), c_{omme formalisé par l’équation (5) :}

% = _𝑎𝑎 _𝑖 𝑃_{− 𝑃 ∗} 𝑎 𝑖

La technique de préparation détaillée ci-dessus a ainsi conduit à la formation de nanoparticules réticulées sur le cisplatine dont la charge moyenne en drogue a été estimée à 3,57 ± 1,37 wt%.

Cette faible efficacité de réticulation des complexes Pt(II) aux fonctions carboxylate du copolymère peut être attribuée à une faible accessibilité des fonctions carboxylate le long des segments polycarbonate du copolymère supposé s’auto-assembler spontanément dans l’eau sous forme de nanoparticules. La PCL forcerait alors à la constitution d’un cœur fortement hydrophobe. La seconde séquence étant supposé à gradient avec une polymérisation plus rapide du carbonate-CO2PhF5 par rapport à l’ -CL, le polycarbonate serait ainsi localisé

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hydrophiles, il est possible qu’ils ne traversent pas facilement la couronne de PEO entourant la nanoparticule. Cependant, bien que la taille de la seconde séquence soit en accord, relativement à celle du PEO amorceur, avec une balance HLB conférant des propriétés amphiphiles au copolymère et _{lui permettant ainsi de s’auto-assembler dans l’eau sous forme} de nanoparticules, le pH légèrement basique du milieu réactionnel rend les chaînes polycarbonate plus hydrophiles et pourrait ainsi interférer dans le processus de formation de nanoparticules. Dans cette configuration, même si les fonctions carboxylate restent relativement accessibles, une compétition avec les ions carbonate issus de la mise en solution du carbonate de sodium peut s’instaurer. Ceux-ci, de par leur concentration en solution et leur accessibilité, seraient alors capables de facilement se complexer au cisplatine, au détriment des fonctions carboxylate du copolymère. Notons par ailleurs que la réticulation des fonctions carboxylate avec le cisplatine redonne de son caractère hydrophobe aux chaînes polycarbonate, permettant ainsi à nouveau l’auto-assemblage dans l’eau des chaînes de copolymère pour former des nanoparticules tout en rendant l’accès aux fonctions carboxylate plus contraint.

L’observation par MET révèle la formation de nanostructures, puisque de taille inférieure à 100 nm dans au moins une d_{es trois dimensions de l’espace. Une telle} morphologie_{, anisotrope dans les différentes dimensions de l’espace comme illustré par la} Figure 3.15, compromet une analyse fine de la distribution de _{tailles de l’échantillon par} diffusion dynamique de la lumière (DLS), cette technique reposant sur _{l’étude de la} diffraction de la lumière par des particules sphériques en solution, i.e. _{animées d’un} mouvement brownien.

Figure 3.15 : Imagerie par MET de nanoparticules

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