Observation par microscopie électronique en transmission

La MET a confirmé l’obtention de nanoparticules d’environ 10 nm dans leur plus grande dimension. Comme le montre la Figure 3.9, les images apparaissent de qualité médiocre car la limite de résolution du microscope est atteinte.

Figure 3.9 : Imagerie par MET de nanoparticules PEO-b-PCL : (A) blanches, et

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4.1.3. Relaxométrie

Dotée d’une résolution spatiale élevée, l’IRM constitue un puissant outil diagnostic pour la détection des tumeurs. Contrairement à la tomographie à rayons X ou aux méthodes d’imagerie nécessitant l’injection de radio-isotopes, l’IRM est non ionisante et non invasive. Dans le cas de certaines pathologies, un agent de contraste peut être injecté au cours de l’examen de façon à rehausser le contraste entre tissus sains et lésés et ainsi établir un diagnostic fiable par comparaison des imageries avant et après injection. Les agents de contraste permettent de raccourcir les temps de relaxation longitudinale (T1) ou transversale

(T2) des protons des molécules d’eau constituant les tissus biologiques environnants de façon

à mettre en évidence des régions où le métabolisme est altéré. Divers chélates de gadolinium sont utilisés en routine clinique dans le but de générer un contraste T1 positif. Leur efficacité

est donnée par les valeurs de relaxivité longitudinale (r1) ou transversale (r2) qui traduisent

leur capacité à raccourcir les temps de relaxation longitudinale (T1), respectivement

transversale (T2), des protons de l’eau en fonction de la concentration locale en gadolinium

(Geraldes & Laurent 2009). Elle dépend donc du nombre de molécules d’eau capables d’interagir avec l’ion paramagnétique de Gd3+ _{et ses sept électrons célibataires. Le contraste}

T1 est d’autant meilleur que la surface de contact entre l’agent de contraste et les protons des

molécules d’eau environnantes est élevée. Le contraste T2 est modulé par la distance entre

l’agent de contraste et les molécules d’eau (Sun et al. 2017). La relaxivité longitudinale r1 de

quelques-uns de ces agents de contraste dans le sang à 7 T, 37 °C, est reportée dans le Tableau 3.2.

Tableau 3.2 : Relaxivité longitudinale de quelques agents de contraste à base de gadolinium utilisés en routine clinique (Shen et al. 2015)

Agent de contraste Relaxivité longitudinale r1 (mM-1 s-1)

Gd-DOTA 2,8 ± 0,4

Gd-DTPA 3,1 ± 0,4

Gd-BOPTA 4,7 ± 0,1

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Dans le cas des nanoparticules synthétisées au cours de ce travail, les segments de PEO, très hydrophiles, forment une couronne autour du cœur hydrophobe de PCL de la nanoparticule. Des échanges peuvent ainsi se produire entre les complexes de gadolinium ancrés en bout de chaîne α des copolymères PEO-b-PCL, et donc localisés à la surface des nanoparticules, et les protons des molécules d’eau, générant ainsi un contraste sur l’image IRM. Dans l’optique d’une utilisation comme macro-agents de contraste, les propriétés relaxométriques des nanoparticules polymère décorées de gadolinium ont ainsi été étudiées dans le plasma à 7 T, 25 °C, comparativement au chélate de gadolinium associé, le Gd-DTPA. Des dilutions en cascade ont été réalisées à partir d’une solution initiale de nanoparticules dans le plasma afin de constituer un phantom d’étude. Une séquence d’acquisition rapide à temps de répétition (TR) variable a été paramétrée de façon à déterminer le T1 de chaque

échantillon. Le pas d’échantillonnage entre deux valeurs successives de TR a été choisi de façon à rendre compte de la repousse de l’aimantation longitudinale au cours du temps, en présence ou non d’agent de contraste. Une région d’intérêt a été tracée au sein d’une zone homogène de l’image pour chaque échantillon de façon à calculer la valeur moyenne de l’intensité du signal dans cette zone, qui est directement proportionnelle à l’aimantation longitudinale de l’échantillon. Le T1 de chaque échantillon est déterminé par modélisation de

la courbe expérimentale représentant l’évolution de l’aimantation longitudinale au cours du temps _{par une exponentielle croissante suivant l’équation (1) :}

= ∗ − − 𝑡 𝑎 𝑖

où : représente l’évolution de l’aimantation longitudinale au cours du temps, noté , et l’aimantation longitudinale initiale de l’échantillon placé dans le champ magnétique ⃗⃗⃗⃗ d’une intensité de 7 T dans notre étude, sans excitation radiofréquence.

De manière analogue, une séquence à échos multiples (MSME) a été paramétrée afin de déterminer le T2 de chaque échantillon. Plusieurs échos de spin sont générés après

sélection d’une coupe du volume à explorer. Chacun des échos consécutifs enregistrés au cours d’un même temps de répétition bénéficie d’un codage de phase spécifique qui lui permet de contribuer à l’encodage d’un espace k différent. La superposition de toutes les composantes du signal acquises à chaque nouveau passage permet l’encodage de l’espace k propre à chaque image. Une telle séquence permet ainsi de réaliser des images pondérées T2

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et dépondérées T1en choisissant TE ≈ T2 et TR > 5 * T1. La mesure de l’amplitude de chaque

écho à chaque te_{mps d’écho permet de décrire l’évolution du signal suivant une enveloppe} exponentielle décroissante en T2. L’intensité moyenne du signal de chaque échantillon,

proportionnelle à son aimantation transversale, a été mesurée sur _{une région d’intérêt} homogène de l’image et modélisée par une exponentielle décroissante traduisant l’annulation de l’aimantation transversale des spins des noyaux d’hydrogène de l’échantillon au cours du temps suivant l’équation (2) :

= ∗ − 𝑡 𝑎 𝑖

où : représente l’évolution de l’aimantation transversale au cours du temps, noté , et l’aimantation longitudinale initiale de l’échantillon placé dans le champ magnétique ⃗⃗⃗⃗ , sans excitation radiofréquence.

Un exemple d’images pondérées T1, respectivement T2, obtenues par IRM est présenté

sur le panneau de gauche de la Figure 3.10. Les images du panneau de droite correspondent aux cartographies T1, respectivement T2, associées. Une fois les temps de relaxation T1 et T2

propres à chaque échantillon extrapolés, leurs inverses, i.e. la vitesse de relaxation longitudinale (R1), respectivement transversale (R2), ont été reportés sur un graphique en

fonction de la concentration en gadolinium des différents échantillons. La relaxivité ri, i=1,2 est

donnée par l’équation (3) :

𝑖 =(𝑇𝑖 − 𝑇𝑖,𝑑

)

[ ] ; 𝑖 = , 𝑎 𝑖 où :

𝑖 est la vitesse de relaxation longitudinale (i = 1), respectivement transversale (i = 2), des

pr_{otons des molécules d’eau pour une concentration en agent de contraste [ ], et}

𝑖,𝑑 la

vitesse de relaxation longitudinale, respectivement transversale, des protons des molécules d’eau en l’absence d’agent paramagnétique.

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Figure 3.10 : _{Images d’un phantom constitué de nanoparticules de DTPA(Gd}3+_)PEO-b-PCL

en solution à différentes concentrations dans le plasma obtenues par IRM à 7 T, 25 °C

(A) image pondérée T2 (TE = 104 ms) et (B) cartographie T2 correspondante ;

(C) image pondérée T1 (TR = 3.000 ms) et (D) cartographie T1 correspondante

Les différents échantillons contiennent du gadolinium à hauteur de :

(1) 0,714 mM, (2) 0,476 mM, (3) 0,357 mM, (4) 0,286 mM, (5) 0,0714 mM, (6) 0 mM (plasma), (7) 0 mM (eau)

Figure 3.11 : Etude de relaxométrie des nanoparticules DTPA(Gd3+_)PEO-b-PCL

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Les données expérimentales ont alors été modélisées par régression linéaire sous GraphPad, comme illustré par la Figure 3.11. Deux droites sont ainsi obtenues (R² > 0,997) dont la pente correspond à la relaxivité longitudinale, respectivement transversale, de l’agent de contraste étudié. Ces valeurs sont reportées dans le Tableau 3.3.

Tableau 3.3 : Comparatif entre relaxivités des nanoparticules de DTPA(Gd3+_{)PEO-b-PCL et}

relaxivités du chélate de gadolinium associé (Gd-DTPA) dans le plasma à 7 T, 25 °C

Relaxivité longitudinale r1 (mM-1 s-1) Relaxivité transversale r2 (mM-1 s-1) r2/r1 Gd-DTPA 6,093 ± 0,044 9.163 ± 0,146 1,504 DTPA(Gd3+_{)PEO-b-PCL 9,440 ± 0,109 18,669 ± 0,368 1,978}

L’ancrage des complexes NH2-Bn-DTPA(Gd3+) en surface des nanoparticules

polymère permet d’obtenir des relaxivités supérieures du macroagent de contraste ainsi synthétisé comparativement au chélate de gadolinium de faible masse molaire, en en ralentissant le mouvement rotationnel à l’échelle moléculaire (Artemov 2003; Geraldes & Laurent 2009; Karfeld-Sulzer et al. 2010; Grogna et al. 2011). Ainsi, les relaxivités longitudinale et transversale des nanoparticules sont plus de une fois et demie, respectivement deux fois, supérieures à celles du Gd-DTPA dans le plasma à 7T, 25 °C. Par conséquent, la vitesse de relaxation des molécules d’eau excitées dans le voisinage du macroagent de contraste sera plus rapide qu’au contact du chélate de gadolinium. Toutefois, le rapport de relaxivités r2/r1 correspondant reste du même ordre de grandeur. Il est important ici de noter

que ces mesures ont été réalisées à un champ magnétique relativement intense de 7 T. Or, la relaxivité longitudinale est inversement corrélée à l’intensité du champ magnétique. Tandis que les chélates de gadolinium de faible masse molaire voient leur relaxivité longitudinale légèrement diminuer lorsque l’intensité du champ magnétique augmente, les macroagents de contraste T1 subissent une chute d’efficacité bien plus importante pour la même variation

d’intensité du champ magnétique. Leur valeur la plus élevée de r1 culmine en effet pour des

intensités du champ magnétique externe couramment comprises entre 0,5 et 1,0 T (Caravan et al. 2009; Mi et al. 2013). Par conséquent, le fait d’immobiliser des chélates de gadolinium sur des macromolécules présente un fort intérêt à des intensités de champ magnétique

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compatibles avec la pratique clinique, qui devient rapidement limité sur des instruments de recherche à plus haut champ. La relaxivité r1 des nanoparticules formulées est donc

probablement plus élevée à des champs magnétiques d’intensité comprise entre 1,5 T et 3 T. Cependant, du fait d’une accessibilité restreinte à des IRM d’intensités de champ magnétique différentes, le profil NMRD de ces nanoparticules n’a pas pu être établi. Une étude portant sur des micelles polymère de structure proche des nanoparticules synthétisées au travers de ce projet de doctorat s’est intéressée à la détermination du profil NMRD des macroagents de contraste obtenus par greffage du même complexe de Gd-DTPA à plusieurs copolymères séquencés de type PEOx-b-PCLy, de degrés de polymérisation différents, comparativement au

chélate de gadolinium initial, à des intensités de champ magnétique comprises entre 0,0002 T et 1,88 T (Grogna et al. 2010). A basses fréquences (inférieures à 10 MHz), dans l’eau et à 25 °C, la relaxivité longitudinale du macroagent de contraste correspond environ au double de celle du chélate de gadolinium, pour atteindre le triple à une fréquence de 40 MHz avant de diminuer à nouveau. Rappelons ici que l’intensité du champ magnétique et la fréquence de précession des spins des noyaux d’hydrogène sont reliées par l’équation de Larmor (4) :

= 𝛾 ∗_𝜋 𝑎 𝑖

où : désigne la fréquence _{de précession des spins des protons de l’eau dans un champ} magnétique externe , et _{𝛾 le rapport gyromagnétique du noyau d’hydrogène} (_{𝛾 = 42,57 MHz.T}-1_).

Cette étude vient donc étayer l’argument avancé précédemment selon lequel le pic d’efficacité de ces agents de contraste macromoléculaires se situerait à des champs magnétiques de faible intensité. Il serait donc intéressant de tester le potentiel de tels agents de contraste à des champs cliniques. Par ailleurs, l’ancrage de complexes de gadolinium à la surface de nanoparticules polymère permet, outre une immobilisation du complexe, d’augmenter la densité d’ions paramagnétiques par particule pour un effet encore plus intense. L’agent de contraste ainsi synthétisé présente donc un potentiel intéressant dans l’optique d’un suivi par IRM de son infusion dans le parenchyme cérébral et de sa biodistribution au cours du temps.

Notons enfin que l’intérêt des agents de contraste T1, contrairement aux agents T2 tels

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contraste positif sur l’image. En outre, ils sont stables dans le temps et permettent de raccourcir les durées d’acquisition, un facteur non négligeable en routine clinique face au nombre considérable d’examens prescrits comparativement au parc d’imagerie national. La recherche sur le développement d_{’agents de contraste de relaxivités élevées a un avenir très} prometteur en clinique puisque de tels agents pourraient être injectés à des doses beaucoup plus faibles pour les examens de routine et offriraient également des perspectives intéressantes pour l’imagerie moléculaire (Caravan et al. 2009). Il reste maintenant à déterminer la concentration en nanoparticules décorées de gadolinium rendant possible un suivi par IRM au cours du temps de leur infusion au sein du tissu cérébral.

4.1.4. Suivi in vivo par IRM de l’infusion convective de nanoparticules polymère