Greffage du complexe de gadolinium en α des nanoparticules PEO-b-PCL par réaction d ’amination réductrice

Le complexe de gadolinium précédemment synthétisé a été g_{reffé en α du copolymère} biséquencé _{α-acétal-PEO-b-PCL par une réaction d’amination réductrice. Le copolymère α-} aldéhyde-PEO-b-PCL (2,44 g ; 292 µmol de fonctions aldéhyde en prenant en compte la contamination du PEO synthétisé par 17 % de PEO téléchélique) a été dissous dans 25 mL de THF. La formation de nanoparticules a été induite par ajout goutte-à-goutte du copolymère en solution organique à un volume de 475 mL de solution tampon de bicarbonate de sodium / hydrogénocarbonate de sodium (0,1 M) à pH 8,5. Le complexe de gadolinium NH2-Bn-

DTPA(Gd3+_{) (343 mg ; 263 µmol de gadolinium ; 0,901 équivalent en regard des bouts de}

chaîne α-aldéhyde) a alors été ajouté à la suspension de nanoparticules. Le mélange a été laissé sous agitation pendant une heure à 25 °C. Une solution de cyanoborohydrure de sodium à 1 M dans le THF (3 mL ; 3,00 mmol ; 11,4 équivalents en regard du complexe NH2-Bn-

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96 heures à 25 °C. A l’issue de la réaction d’amination réductrice, les nanoparticules ont été purifiées par dialyse contre _{de l’eau distillée (seuil de coupure : 3,5 kD) pendant 48 heures} avant _{d’être lyophilisées. L’ancrage du gadolinium sur les nanoparticules entraînant une chute} du temps de relaxation de la molécule, le produit final ne peut pas être analysé par RMN. Le rendement de la réaction d’amination réductrice a donc été déterminé par dosage du gadolinium par ICP-MS.

Efficacité du greffage (ICP-MS) : 49 %.

Bien que plus toxique que le borohydrure de sodium (NaBH4), le cyanoborohydrure de

sodium (NaBH3CN) est largement utilisé dans le cadre d’applications biomédicales (Torisawa

et al. 2001; Freichels et al. 2012). Il a été choisi ici comme agent réducteur pour assurer le greffage des complexes de gadolinium en α des copolymères triséquencés. Il est éliminé à l’issue de la réaction d’amination réductrice par dialyse contre de l’eau distillée. La réaction d’amination réductrice présente une efficacité modérée principalement imputée à l’encombrement stérique induit par les complexes de gadolinium déjà greffés à la couronne de PEO des nanoparticules. Toutefois, du fait de la mobilité réduite du complexe de gadolinium une fois ancré à la nanoparticule comparativement au chélate de gadolinium Gd-DTPA de faible masse molaire_{, l’agent de contraste macromoléculaire ainsi synthétisé est en mesure de} présenter des propriétés relaxométriques intéressantes permettant d’intensifier les différences de contraste entre tissus à l’IRM (Artemov 2003; Geraldes & Laurent 2009).

3.2. Synthèse d’un copolymère amphiphile fonctionnalisable en vue d’une réticulation sur le cisplatine

Les conditions de synthèse _{d’un copolymère amphiphile innovant par ouverture de} cycle concomitante de (2,3,4,5,6-pentafluorophényl)-5-méthyl-2-oxo-1,3-dioxane-5- carboxylate, noté carbonate-CO2PhF5 dans la suite, et d’ -caprolactone à partir du groupement

hydroxyle terminal d’un poly(oxyde d’éthylène) méthyl éther commercial ont été mises au point et optimisées sur la base des travaux de l’équipe de J. L. Hedrick menés au centre de recherche IBM d’Almaden (Sanders et al. 2010; Engler et al. 2013; Engler et al. 2015). Les différentes étapes de synthèse et de fonctionnalisation sont illustrées par la Figure 3.2. Les longueurs du PEO, très hydrophile, et de la séquence statistique en poly[(carbonate- CO2PhF5)x–co–( -CL)y]z, hydrophobe, ont été choisies afin de permettre l’auto-assemblage

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fonctionnalisation ultérieure en deux étapes a consisté à éliminer les groupements pentafluorophényle protégeant une fonction ester le long des segments polycarbonate au profit de fonctions alcool, converties à leur tour en fonctions acide carboxylique, _{dans l’optique de} formuler des nanoparticules réticulées sur le cisplatine.

3.2.1. Synthèse du monomère carbonate cyclique (2,3,4,5,6-pentafluorophényl)-5- méthyl-2-oxo-1,3-dioxane-5-carboxylate (noté carbonate-CO2PhF5)

Le carbonate-CO2PhF5 a été synthétisé suivant une procédure décrite dans la littérature

(Sanders et al. 2010). L’acide 2,2-bis(hydroxyméthyl)propionique (3,40 g ; 25,3 mmol), le bis-(pentafluorophényl)carbonate (25,0 g ; 63,4 mmol ; 2,5 équivalents), le fluorure de césium catalysant la réaction (0,772 g ; 5,08 mmol ; 0,20 équivalent) et le THF anhydre (80 mL) ont été introduits dans un ballon de 250 mL. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation pendant 20 heures à température ambiante. Le solvant a alors été éliminé sous vide avant redissolution du produit dans du dichlorométhane anhydre. Un sous-produit, identifié en RMN du fluor comme le pentafluorophénol, a immédiatement précipité en présence de dichlorométhane et ainsi pu être éliminé par filtration. Le filtrat a alors été lavé à l’aide de bicarbonate de sodium et d’eau distillée, puis séché au sulfate de magnésium. Après évaporation du solvant sous vide, le produit a été recristallisé à deux reprises dans un mélange d’acétate d’éthyle et d’hexane pour finalement former une poudre cristalline blanche, le carbonate-CO2PhF5. Le monomère ainsi synthétisé a été analysé en RMN 1H et 19F dans le

chloroforme deutéré. Les caractérisations obtenues, reportées sur la Figure 3.6, étaient en accord avec celles décrites dans la littérature.

Rendement : 6,47 g (78 %). Pureté : 99,5 %. RMN 1_{H (400 MHz, TMS, CDCl} 3) : = 1,56 ppm (s, 3H, –CH2–C(CH3)–CH2–), = 4,35-4,38 ppm (d, 2H, –CHaHb–, 2_J HH = 6 Hz), = 4,84-4,86 ppm (d, 2H, –CHaHb–, 2JHH = 6 Hz). RMN 19F (400 MHz, TMS, CDCl3) : = -152,80 ppm (m, 2F), = -156,03 ppm (t, 1F, 3JFF = 24 Hz), = -161,16 ppm (m, 2F).

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(A)

(B)

Figure 3.6 : Spectres RMN (A) 1_{H et (B)} 19_{F du carbonate-CO} 2PhF5

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3.2.2. Synthèse d’un copolymère PEO-b-poly[(carbonate-CO2PhF5)–co–(ε-CL)]

Le poly(_{oxyde d’éthylène) méthyl éther (4,00 g ; 𝑃}̅̅̅̅_{, , CTHF}= 120 ; 0,757 mmol) pesé dans un ballon a été déshydraté par trois azéotropes successifs dans le toluène anhydre. Le carbonate-CO2PhF5 (2,00 g ; 6,13 mmol ; 8,1 équivalents) a alors été introduit dans le

ballon contenant le PEO en boîte à gants. Trois cycles vide-azote suivis d’un dernier azéotrope du mélange PEO – carbonate-CO2PhF5 dans le toluène anhydre ont été réalisés de

façon à éliminer toute trace d’eau ou d’air résiduelle. Une fois le mélange de produits sec, l’ - caprolactone distillée (0,67 mL ; 6,05 mmol ; 8,0 équivalents) a été versée dans le réacteur porté à 37 °C. Le dichlorométhane anhydre (25 mL) a alors été ajouté au mélange afin de complètement solubiliser les espèces en présence. Une fois le mélange homogène, _l’acide trifluorométhanesulfonique (0,67 mL ; 7,57 mmol ; 10 équivalents), catalyseur de la polymérisation par ouverture de cycle amorcée par le bout de chaîne _{ω du poly(oxyde} d’éthylène) méthyl éther, a été injecté sous flux d’azote dans le réacteur. Le mélange réactionnel a été laissé sous agitation vigoureuse pendant 13 heures, et la cinétique d’avancement de la polymérisation a été suivie par RMN 1_{H dans le chloroforme deutéré et}

par _{chromatographie d’exclusion stérique dans le THF. Une fois les 95 % de conversion} atteints pour le carbonate-CO2PhF5 et l’ -CL, le bout de chaîne ω du copolymère ainsi

synthétisé a été estérifié par réaction avec la triéthylamine et le chlorure d’acétyle. Le copolymère a d’abord été dilué sous forte agitation dans le solvant de la réaction jusqu’à atteindre une solution à 20 % en masse. Une fois la température du ballon stabilisée à 35 °C, la triéthylamine distillée (1,57 mL ; 11,3 mmol ; 15 équivalents par rapport au bout de chaîne ω du copolymère) et le chlorure d’acétyle (0,800 mL ; 11,3 mmol ; 15 équivalents par rapport au bout de chaîne ω du copolymère) ont été introduits. Le mélange réactionnel a ainsi été laissé sous agitation vigoureuse à 35 °C pendant 72 heures avant purification du copolymère par précipitation dans l’éther diéthylique froid puis filtration et séchage. Le solide récupéré sur le filtre a ensuite été repris dans un minimum de dichlorométhane : la fraction du produit soluble dans le dichlorométhane a été précipitée une seconde fois dans l’éther diéthylique froid, filtrée et séchée en chambre froide à 6 °C, tandis que la fraction insoluble dans le dichlorométhane, assimilée à un sel de triéthylamine résiduel, a été éliminée. Après 6 heures de dialyse contre de l’eau distillée (seuil de coupure : 1 kD) puis lyophilisation, le copolymère a été analysé par RMN 1_{H, comme rapporté sur la Figure 3.7-(A), et RMN} 19_{F dans le}

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chloroforme deutéré, ainsi que par _{chromatographie d’exclusion stérique dans le THF et le} DMF.

Rendement : 3,61 g (54 %). RMN 1_{H (400 MHz, TMS, CDCl}

3) : = 1,36 ppm (m, 12H, –

C(O)_–CH2–CH2–CH2–CH2–CH2–O–), 1,48-1,49 ppm (d, 15H, –CH3), = 1,66 ppm (m, 24H,

–C(O)–CH2–CH2–CH2–CH2–CH2–O–), = 2,20-2,37 ppm (m, 12H, –C(O)–CH2–CH2–CH2–

CH2–CH2–O–), = 3,38 ppm (s, 3H, CH3–O–CH2–CH2–O–), = 3,64 ppm (s, 480H, –O–

CH2–CH2–O–), = 4,06-4,31 ppm (m, 12H, –C(O)–CH2–CH2–CH2–CH2–CH2–O–),

= 4,36-4,46 ppm (m, 20H, –O–CH2–C(CH3)(CO2PhF5)–CH2–O–). ̅̅̅̅𝑃 _{, C,} = 5,

𝑃

̅̅̅̅ _{, C ,} = 6, Ð = 1,20. RMN 19_{F (400 MHz, TMS, CDCl}

3) : = -78,41 ppm (3F,

CF3SO3H), = -153,00 ppm (m, 2F), = -157,10 ppm (m, 1F), = -161,95 ppm (m, 2F).

Chaque monomère a été introduit de façon à atteindre un degré de polymérisation moyen de 8, soit une masse molaire moyenne de la deuxième séquence de 3.450 g.mol-1_{. Le}

degré de polymérisation théorique moyen de chaque espèce est déterminé à l’aide des formules suivantes : ̅̅̅̅_{𝑃 , C,t =} [ r t −C ]

[ − ] , ̅̅̅̅𝑃 , C ,t =

[ε−C ]

[ − ] , où l’acronyme

« PC » désigne les segments polycarbonate et « PCL » la polycaprolactone. Le degré de polymérisation expérimental moyen du PC a été déterminé par RMN 1_{H en se basant sur le}

rapport entre l’intégrale du signal des 4 protons de l’unité répétitive du polycarbonate à 4,46 ppm normalisée par l’intégrale du signal des 4 protons de l’unité répétitive du PEO à 3,64 ppm suivant la formule : ̅̅̅̅_{𝑃 , C, = 𝑃}̅̅̅̅ _{, , 𝐸 𝑇𝐻𝐹∗} té r l . ppm

té r l . ppm. De manière

analogue, le degré de polymérisation expérimental moyen de la PCL a été déterminé par RMN 1_{H en se basant sur le rapport entre l’intégrale du signal des 2 protons de l’unité}

répétitive de la PCL à 4,06 ppm normalisée par l’intégrale du signal des 4 protons de l’unité répétitive du PEO à 3,64 ppm suivant la formule : ̅̅̅̅_{𝑃 , C , = 𝑃}̅̅̅̅_{, , 𝐸 𝑇𝐻𝐹∗ ∗}

té r l . ppm

té r l . ppm. La cinétique de la polymérisation a ainsi été suivie par RMN

1_{H dans le}

chloroforme deutéré jusqu’à atteindre 95 % de conversion des deux monomères. Après estérification du bout de chaîne ω et purification, le copolymère final présente une seconde séquence en polycarbonate et en polycaprolactone avec des degrés de polymérisation moyens de 5 et 6 respectivement.

Ainsi, les conditions de _{copolymérisation simultanée par ouverture de cycle de l’ -CL et du} carbonate-CO2PhF5 à partir du groupement hydroxyle en bout de chaîne ω d’un poly(oxyde

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cinétique de cette réaction a été suivie par RMN 1_{H et a montré une incorporation}

préférentielle du carbonate, générant un copolymère à gradient. A _{l’issue de cette première} étape de synthèse, les deux types de copolymères semble_{nt pertinents à l’application finale de} par le choix des masses molaires des deux séquences. En effet, une fois en milieu basique, les segments de poly(carbonate-spacer-COOH) sont déprotonés et perdent de leur hydrophilie. On retombe alors sur une HLB (5.300 g.mol-1 _{/ 2.200 g.mol}-1_{) compatible avec des propriétés}

amphiphiles du copolymère séquencé.

Un second copolymère biséquencé plus riche en unités carbonate a été synthétisé suivant le même protocole à partir d’un poly(oxyde d’éthylène) méthyl éther de masse molaire moyenne en nombre de 10.560 g.mol-1 _{(̅̅̅̅𝑃}

, , CTHF= 240).

Rendement : 2,07 g (59 %). ̅̅̅̅_{𝑃 , , CTHF} = 240, ̅̅̅̅_{𝑃 , C,} = 14, ̅̅̅̅_{𝑃 , C ,} = 20,

Ð = 1,35.

La balance hydrophile-lipophile entre les deux séquences ainsi que le ratio ente unités PC et PCL sur la seconde séquence devaient être préservés afin de comparer les caractéristiques des formulations ultérieures réalisées à partir de ce copolymère à celles obtenues sur le copolymère PEO120-b-poly[(carbonate-CO2PhF5)5–co–( -CL)6] présenté

précédemment. L’idée sous-jacente consiste à démontrer qu’une augmentation du nombre de groupements carboxylate le long des chaînes polycarbonate après fonctionnalisation du copolymère permettrait d’améliorer la charge de complexes de Pt(II) encapsulés dans la nanoparticule par réticulation entre le cisplatine et les fonctions carboxylate.