La préparation des échantillons pour les observations en microscopie

3.3.1.1 La fixation

La fixation chimique consiste à ponter les protéines afin de créer une réticulation artificielle pour pouvoir éliminer l’eau tout en conservant la trame structurale d’origine. Les fixateurs utilisés sont des aldéhydes en mélange avec du para formaldéhyde (PFA) à 4% et de glutaraldéhyde à 0,5% dans un tampon phosphate 0,2 M à pH 7,2. Le fixateur est légèrement alcalinisé par de la soude (20 μl de NaOH 1N pour 10 ml de fixateur). Le fixateur se prépare extemporanément en milieu tamponné. La fixation dure 1h30 minimum mais ne doit pas dépasser 12h afin de ne pas dégrader le matériel.

Pour les échantillons issus de plantes fraîches, la fixation se réalise au frais ~ 4°C dans une glacière pour les prélèvements au champ et sur de la glace pilée au laboratoire.

Pour les échantillons issus des différentes voies de transformation (rouissage et matériel « extérieur »), la fixation chimique n’est pas obligatoire (les tissus étant déshydratés) toutefois cette étape s’est avérée importante lors de l’amélioration des protocoles.

Pour certains échantillons, une étape de post-fixation à l’acide osmique a été réalisée (1 % OsO4 dans le tampon phosphate 0,2 M, pH 7,2). Cette post-fixation permet la réticulation des lipides et notamment des membranes plasmiques des échantillons. Cette étape sert aussi de contrastant car elle provoque le noircissement des échantillons. L’acide osmique étant très dangereux et pas nécessaire dans le cas d’échantillon de tiges matures ou d’échantillons secs, cette étape a été retirée de la plupart des inclusions réalisées. Toutefois, il est nécessaire de souligner que cette étape demeure indispensable pour les

préparations d’échantillon pour l’observation en microscopie électronique à transmission (MET).

Après la fixation, les échantillons sont rincés dans le tampon phosphate (0,2 M, pH 7,2) au moins trois fois pendant 20 minutes. Afin d’optimiser les lavages, cette étape peut se passer sous vide. Le tampon phosphate peut-être enrichi en saccharose (7,5% de saccharose) pour maintenir l’osmolarité des tissus et préserver au maximum leur intégrité. Le saccharose a été ajouté au tampon phosphate pour les inclusions provenant de tissus frais uniquement. Les autres échantillons ne nécessitent pas cet apport étant donné que seules restent les parois des cellules mortes.

Du fait de la difficulté d’inclure les fibres dans les résines, des passages sous vides ont été ajoutées dès la fixation puis à chaque étape pour favoriser le succès des inclusions. 3.3.1.2 La déshydratation

Le principe est de faire subir à l’échantillon des bains successifs de concentration croissante en alcool : 20, 50, 70, 95 et 100% de 10 min chacun afin de déshydrater complètement l’échantillon et favoriser les inclusions en résine. La déshydratation des échantillons transformés débute à compter de l’alcool 70%.

3.3.1.3 L’imprégnation

L’imprégnation permet une bonne diffusion de la résine dans tout l’échantillon. Cette étape vise notamment à chasser les gaz encore présents à ce stade. Le choix de la résine s’est porté sur une résine de type acrylique LR White Medium car elle conserve l’accessibilité aux composés pariétaux, optimisant les analyses biochimiques ultérieures tout en assurant des études ultrastructurales. (Les résines epoxy comme l’araldite ou l’epon ne permettent que des études ultrastructurales).

Pour l’imprégnation en résine, les échantillons déshydratés sont immergés dans des bains mixtes LR White Medium / alcool éthylique de teneur croissante en résine pendant 8h.

Ensuite, le dernier bain est constitué de 100% LR White Medium et est répété au minimum deux fois avec des temps très long (de 12 à 24h) comprenant systématiquement une période de vide d’une heure avant de laisser sous une hotte. Il est nécessaire de bien veiller à laisser les tubes d’imprégnation ouverts sous la hotte (car cela favorise l’évaporation de l’éthanol 100%) ainsi que dans le frigidaire quand ils sont déposés pour la nuit.

L’inclusion des échantillons se fait dans des capsules de gélatine préalablement étiquetées au crayon avec des petites bandelettes de papier placée à l’intérieur (le crayon ne diffuse pas contrairement à l’encre, cette étape reste exclusivement manuscrite). L’étape d’inclusion est minutieuse car il est important de bien veiller à l’orientation de l’échantillon dans la gélule pour optimiser les coupes ultérieurement. La polymérisation de la résine s’effectue dans une étuve (2 jours à 55 °C).

3.3.1.4 Coupe des échantillons

Des coupes semi-fines de 800 à 1500 nm d’épaisseur sont débitées à partir des blocs échantillons avec un ultramicrotome Leica eMuC6_{®. Un couteau de verre est employé pour} générer les coupes. Dans le cadre de l’ultramicrotomie, une grande différence avec le couteau à lame vibrante réside dans le fait que ce soit l’échantillon qui bouge face au couteau qui est fixe. Le couteau est muni d’un réservoir rempli d’eau osmosée pour favoriser la propreté et la récupération des coupes.

Les coupes sont ensuite récupérées soit par capillarité avec des anneaux dédiés soit avec un cil monté sur une tige. Elles sont ensuite évaluées brièvement par une coloration rapide au bleu de toluidine (1 goutte de bleu de toluidine à 0,1% dans l’eau) afin de veiller à l’orientation des coupes ou encore à la qualité de l’inclusion. Enfin, les coupes sont déposées sur des lames à puits traitées au Vectabond® pour favoriser leur adhésion. Les lames ainsi préparées sont mises à sécher sur plaque chauffante (à 30 °C) quelques minutes puis elles peuvent être observées en microscopie photonique.

Pour la microspectrométrie FT-IR, les coupes sont déposées sur les lames BaF2 (Le difluorure de barium étant très perméable aux infra-rouges), taille des lames : 13 mm de diamètre, 2 mm d’épaisseur) et l’adhésion des coupes se fait par la chaleur. Il est nécessaire que l’échantillon soit bien sec sur la lame car l’excès d’eau absorbe dans la lumière IR. Toutefois il faut aussi veiller à ne pas laisser trop longtemps les lames sur plaques chauffantes car elles sont très fragiles et la chaleur les fragilise d’autant plus. Cette étape de dépôt de coupes sur les lames Ba F2 requiert donc une forte vigilance.