Mise au point des méthodes en analyse d’image avec Image J

Le travail sur tissus frais ou tissus fixés en alcool 70% et l’observation en fluorescence permettent notamment des études structurales assistées par informatique. Des mises au point en analyse d’image ont été réalisées avec le logiciel Image J dans le but d’extraire les massifs de fibres phloémiennes et de les caractériser en termes de surface (% de fibres contenu dans l’écorce), de taille et de nombre. L’approche développée consiste en une observation à plusieurs échelles (du X 100 avec la loupe au X 600 avec le MCBL) afin de mesurer respectivement la proportion de fibres puis caractériser les fibres plus précisément avec des critères de taille et de forme.

Le développement de l’approche en analyse d’image a été réalisé à partir de coupes transversales de tige de Félina 32 adulte cultivée dans la serre. Ceci permet de se dispenser des plantes en champ qui ne sont disponibles qu’en fin de saison de culture. La plante modèle mesure 2,39 m et a été fixée en alcool 70% (§ Méthodes).

2.1.2.1 Caractérisation de la proportion des fibres dans l’écorce des tiges de chanvre La caractérisation de la surface des fibres contenues dans l’écorce se déroule en deux étapes. A partir des images acquises à l’objectif X20 au MCBL, une première étape concerne la mesure de la surface des tissus comprenant les fibres primaires et secondaires.

Pour se faire, plusieurs approches sont possibles. La première est axée sur le calcul d’aire, le détourage de la zone fibre sur la coupe transversale de tige étant réalisé manuellement avec l’outil dessin d’Image J (la commande sous Image J est dans la barre des tâches sous l’icône courbe classique). La mesure de la surface ainsi délimitée se réalise avec le logiciel (la commande sous Image J est dans Analyze/ Measure). Sur l’exemple montré Figure 57, l’aire de l’écorce mesurée est de 295 922 μm2 _{(Figure 57, A) et l’aire des fibres mesurée est de 132 969 μm}2 _(Figure 57, B). Ces mesures permettent de calculer rapidement les proportions de fibres primaires et secondaires dans une image. Mais de rapporter ces aires à la surface totale de la tige nécessite de connaître l’angle de courbure de la zone considérée ce qui n’est pas forcément trivial.

Figure 57. Exemple de mesure de proportion surfacique de l’écorce (A), des fibres et du parenchyme phloémien(B), des fibres primaires (C) et des fibres secondaires (D). Les images de section de coupe transversale de tige de chanvre sont obtenues au MCBL après coloration à l’acridine orange....

La mesure de segments dans l’image permet de calculer les mesures des cylindres correspondant aux différentes zones étudiées (Ecorce, Fibres+parenchyme, Fibres primaires, Fibres secondaire, Figure 57). Connaissant le diamètre de la tige correspondant à la zone étudiée, il est possible de calculer des proportions. Pour cet exemple, le diamètre de la tige à cet endroit, mesuré au pied à coulisse, est de 8,65 mm. Considérant une tige cylindrique, l’aire de la section transversale complète de la tige calculée est de _{π (8,65/2)}2 _{= 58, 77 mm}2_. Grâce aux mesures des différents segments sur l’image, il est possible de calculer les aires

surface de l’écorce par rapport à la surface de tige entière (58,77/12,85 * 100) donne donc 22%. En considérant le deuxième segment sur l’image (mesuré à 432 μm), le calcul donne 18% de proportion d’écorce dans la tige. Ces données permettent d’avoir une idée de la proportion d’écorce dans la tige de 20 _{± 2% de la surface totale de la tige.}

Dans le même principe, les proportions des tissus peuvent être calculées et les résultats sont répertoriés dans le tableau 10. La technique de mesure employée correspond au tracé de segments sur les tissus considérés. La somme des deux types de fibres correspond alors 11,5 _{± 1% de la proportion de la surface de la tige soit 57% de moins que} dans la première approche de mesure qui considérait l’écorce entière, soit l’ensemble des fibres et le parenchyme phloémien. Dans ce dernier cas, seules les fibres sont considérées, le tissu parenchymateux entre les deux types de fibre est exclu. En effet, comme référencé dans le tableau 10, en considérant l’écorce entière comme région fibreuse, la perte de précision est forte, et la proportion de fibres (FI et FII) dans l’écorce est calculée à 56 _{± 8,2 %,} et le calcul de la proportion de fibres dans ce cas est surestimé à hauteur de 44% dans ces mesures.

...

Figure 58. Dénombrement des fibres primaires et secondaires par l’outil dédié sous Image J. L’image considérée est la même que celle précédemment (Figure 57).

Afin de déterminer précisément le nombre de fibres contenus dans ces surfaces, il est possible d’utiliser l’outil de dénombrement d’Image J (la commande sous Image J est dans

Plugins/ Analyze/ Cell Counter) (Figure 58). Dans cette zone de coupe transversale, 142 fibres

La synthèse de ces données est répertoriée dans le tableau 10. Tableau 10. Récapitulatif des proportions de surface de fibres calculées avec Image J.

Zone considérée Aire (mm2) Proportion de la surface de la tige (%) Proportion de fibres primaires (%) Proportion de fibres secondaires (%) Proportion de surface d’écorce restante (%) Ecorce (Figure 55, A) 11,16/12,85 20 _{± 2} 49 _{± 8} 7 _{± 0,2} 44 _{± 8,2} Fibres + Parenchyme (Figure 55, B) 8,96/7,77 14 ± 1 69,5 ± 1,5 12± 1 18,5 ± 2,5

Fibres primaires (FI)

(Figure 55, C)

6,32/5,32 9,9 ± 0,9 (142 fibres)

100 0

Fibres secondaires (FII)

(Figure 55, D) 0,82/0,88 1,35 _fibres) ± 0,1 (64 100 0

Somme FI + FII

(Figure 55, C et D)

7,17/6,2 11,25 _{± 1} 87,5 _{± 1,5} 12,5 _{± 1,5} 0

Il est à noter que cette approche est réalisée sur une coupe transversale de tige de chanvre réalisée à partir d’un quart de tige de bas de la plante Félina 32 utilisée comme modèle pour le développement des méthodes d’analyse d’image. Les détails de localisation de la coupe ne sont pas présentés car le but de ce paragraphe est de souligner la faisabilité de l’approche et la diversité des résultats qu’elle peut engendrer.

Des mesures de proportions de surface à partir des images de coupes transversales de tige de chanvre observées à la loupe peuvent être réalisées. Cette approche a été utilisée pour l’étude de la répartition des fibres en fonction de la position dans la tige (§ 2.2 Répartition et mise en place des fibres longues dans la tige de chanvre). En revanche, le grossissement maximal de la loupe (X115) n’est pas suffisant pour compter les fibres individuellement.

différents tissus sur des cercles concentriques supposées de la tige de chanvre ne sont pas toujours justes. En bas de plante, les tiges sont souvent plus lisses mais les massifs de fibres primaires et secondaires se répartissent différentiellement (§ 2.2 Répartition et mise en place des fibres longues dans la tige de chanvre). Il serait nécessaire d’évaluer à l’échelle de la coupe transversale entière qu’elle est la réelle distribution des fibres. Le plan d’échantillonnage initial mériterait d’être calibré sur des sections transversales entières de tige, car l’hypothèse d’une répartition homogène des fibres sur le cylindre de la tige n’est pas forcément vraie.

Les coupes transversales de chanvre entières sont très difficiles à obtenir avec les outils à disposition au laboratoire. Toutefois, il est possible de réaliser de belles sections transversales entières avec un microtome à glissière aidé par un moteur électrique. L’accès occasionnel de ce type de matériel a permis de tester la faisabilité de cette piste. L’approche multi-échelle envisagée n’a pas donc pas pu être optimisée car elle nécessite différents outils. Toutefois, dans l’idée d’une uniformisation de méthodes de mesures dédiées à la caractérisation des fibres in planta, ce point d’étude mérite d’être souligné.

Cependant, il reste possible de présenter les résultats obtenus sur une portion de coupe puis en calculant la surface cylindrique de la couronne correspondante aux tissus d’intérêt, comme présenté précédemment. Cette approche, même si biaisée, apporte des informations de proportion de tissus qui permettent de comparer ensuite des plantes entre elles. Cela permet d’étudier l’influence d’un facteur agronomique sur la répartition des fibres par exemple. Pour l’étude de la répartition des fibres primaires et secondaires en fonction de la hauteur dans la tige de chanvre, ces méthodes ont été appliquées (§ 2.2.1 Répartition des fibres longues dans la tige de chanvre).

Une autre étude de proportion des différents tissus constitutifs de la tige de chanvre a été réalisée en 2006 par Schäfer et al.. Dans leur approche, ils ont aussi considéré une répartition homogène des différents tissus en cercles concentriques mais n’ont pas calculé les surfaces correspondantes. En effet, ils ont mesuré les épaisseurs des différents tissus et les ont comparés sur différentes plantes pour mettre en évidence l’influence de facteurs agronomiques (densité de semis, apport azoté).

Les proportions de fibres longues de chanvre sont indiquées dans la littérature entre 30 et 35% (Bouloc, 2006), mais les méthodes de mesure sont axées sur les calculs de poids sec après séparation mécanique de la paille. Une mesure de poids n’est pas évidente à comparer à des mesures de proportion de surface mais l’idée est de souligner ici

l’importance des tissus constitutifs de la tige de chanvre : ils ne sont pas exclusivement séparés en fibres et bois et cette dimension est à prendre en compte pour une valorisation pertinente de la plante. Dans ces mesures, basées sur les poids secs, la partie fibreuse est surestimée aussi car les autres tissus constitutifs de l’écorce sont présents (épiderme, collenchyme, parenchyme phloémien, cambium). De plus, les proportions de fibres ne concernent pas uniquement les fibres primaires mais aussi les fibres secondaires. Une étude de 2005 sur les fibres extraxylémiennes de chanvre (Crônier et al., 2005) rapporte une proportion de fibres secondaires de 25% en bas des tiges. Ce point d’étude souligne la vigilance qu’il faut accorder aux critères de caractérisation des fibres de chanvre. Bien que seules les fibres primaires de chanvre soient considérées comme fibres nobles du chanvre, et qu’elles sont principalement présentes par rapport aux fibres secondaires, il ne faut pas attribuer tout le poids sec de la partie fibreuse aux fibres primaires. En effet, la partie fibreuse correspond à l’écorce séparée du bois au niveau du cambium, et reste constituée de différents tissus eux même constitués de différents types cellulaires. Pour la valorisation de cette biomasse, il est important d’en souligner l’hétérogénéité.

2.1.2.2 Caractérisation des fibres de chanvre

Comme vu précédemment pour les acquisitions au MCBL, seules les ondes récupérés dans le vert (500 nm < _λvert < 530 nm) et dans le rouge (555 nm < λrouge < 625 nm) révèlent la coloration métachromatique pariétale (C, Figure 54). Seules les images acquises en MCBL ont pu être segmentées, en effet ce mode d’acquisition offre la possibilité de réaliser de fines sections optiques de l’échantillon (§ Méthodes). La segmentation des fibres primaires et secondaires a été possible grâce au développement de l’approche « masque » La séparation des canaux de réception de la lumière (_λvert etλrouge) permet d’effectuer la démarche d’extraction des fibres dans les images, alors que ça n’est pas possible avec les images acquises avec la loupe à fluorescence ou avec le microscope photonique classique. Ces dernières sont de vraies images RGB où les canaux ne peuvent être séparés ce qui n’offre pas les mêmes possibilités d’exploitation en analyse d’image.

Après acquisition, les séquences d’images correspondantes en format .oib peuvent être compilées sous Image J. Pour ce faire, il faut ouvrir le fichier et choisir l’option « merge RGB » que le logiciel proposera à la lecture du format .oib. Cette étape permet de gérer ensemble les deux gammes de fichier acquises (le vert et le rouge). A ce stade, la séquence en z est lisible de manière dynamique. Pour fixer l’image 3D il est nécessaire de la compiler (la commande utile est dans Image/stacks/Zproject du logiciel Image). L’image correspondante a des couleurs inversées par rapport au MCBL (Figure 59), mais il est nécessaire de rappeler que cela reste des couleurs informatiques qui restent attribuées aux longueurs d’onde d’émission (555 nm < _λrouge < 625 nm et 500 nm < λvert < 530 nm).

Il est important de ne pas « calibrer » l’image (i.e de ne pas lui ajouter une échelle), car l’échelle incrustée dans l’image sera extraite comme un « objet ». Pour rappel, les fichiers .oib sont automatiquement dimensionnés (pour les X40 l’image est en 800X800 pixels correspondant à 367,60X367,60 μm). Mais il est nécessaire de veiller au format de l’image si elle est acquise avec un autre système MCBL afin de vérifier si elles sont bien calibrées pour les étapes de mesures ultérieures. Si l’image acquise n’est pas calibrée, il est nécessaire de penser soit à prendre une mire pour chacun des objectifs et calibrer ensuite les images, soit à connaître la résolution du système d’acquisition (combien de microns par pixel). Cela rajoute une étape de traitement, pourtant essentielle pour les mesures (La commande sous ImageJ pour la calibration des images correspond à Analyze/set scale ou Analyze/calibrate).

Figure 59. Représentation de l’inversion des couleurs informatiques attribuées aux longueurs d’onde d’émission (555 nm < λλλλrouge < 625 nm et 500 nm < λλλλvert < 530 nm) sur une coupe transversale de chanvre. A.

l’image acquise au confocal et enregistrée en .jpg et B. l’image acquise au confocal, enregistrée au format .oib et compilée sous image J. La flèche indique la lamelle moyenne. Echelle 100 μm. (Fp : fibres primaires).

A ce stade, les canaux vert et rouge peuvent être séparés. La commande sous image J se trouve dans l’onglet Image/color/RGB Split. Il est à noter qu’il est possible aussi d’ouvrir le fichier .oib en séparant les canaux mais cela oblige l’expérimentateur à compiler les deux fichiers et cela rajoute donc une étape.

L’approche d’analyse d’image développée (Figure 60) consiste à utiliser les images acquises dans le rouge (555 nm < _λrouge < 625 nm) comme masque. Il s’agit d’utiliser le signal de la lamelle moyenne pour détourer les fibres. Le signal est perceptible dans le rouge après coloration à l’acridine orange, ce qui facilite la segmentation des fibres (3, Figure 60). Il faut que le contraste de cette image soit suffisamment fort pour faciliter le choix du seuil par l’expérimentateur. Le seuil est propre pour chacune des images, et il doit correspondre au maximum des pixels représentatifs de la lamelle moyenne. Cette étape est limitante car reste à la libre appréciation du manipulateur, si le seuil choisi est trop bas, le détourage des fibres ne sera pas complet et la segmentation des fibres sera plus difficile. A l’inverse, si le seuillage est trop élevé, le risque est de réduire la taille des fibres extraites ultérieurement et donc d’introduire un biais dans les mesures.

Figure 60. Exemple de la première étape du traitement d’image par Image J réalisée à partir de coupes transversales de chanvre (C. sativa) colorée à l’acridine orange et observée au MCBL. 1. Image combinée « vert et rouge » (les couleurs sont inversées par rapport au MCBL). 2. Canal « rouge » séparé (555 nm < λλλλvert < 625 nm) correspondant aux composés cellulosiques. 3. Canal « vert » séparé (555 nm < λλλλrouge < 625

avant l’opération mathématique il faut la transformer sous Image J (la commande sous Image J est

Image/type/ 8 bits). Le seuillage de l’image obtenue, correspondant à l’image des fibres moins celle de la lamelle moyenne (B, Figure 61), est à son tour effectué de manière automatique. Il est à noter que du fait de l’opération mathématique soustrayant le masque A à l’image 2, les particules correspondant aux fibres peuvent être alors facilement extraites (la commande sous Image J est Analyze/Analyze Particle). La commande d’extraction des particules propose des bornes de taille. Ces bornes sont calibrées manuellement. En effet, si l’extraction des particules est effectuée sans bornes, des problèmes de sur-segmentation sont induits, c’est- à-dire que d’autres objets que les fibres sont extraits des images. La borne minimale d’aire de 50 μm2 _{optimise la segmentation des fibres. Toutefois, pour chacune des images} segmentées, il est toujours nécessaire de se référer à l’image source pour vérifier que ce sont bien des fibres qui ont été extraites.

Les paramètres mesurés varient en fonction du choix du manipulateur. Pour la caractérisation morphologique des objets fibres, des critères de taille et de forme ont été testés.

Figure 61. Exemple de la séquence de segmentation des fibres primaires de chanvre via l’approche « masque » développée sous Image J. L’image A correspond au seuillage de l’image 3 de la Figure 3. L’image B est le résultat de l’image 2 de la Figure 3 avec la soustraction du masque A. L’image C est le résultat de la binarisation de l’image B, enfin l’image D correspond à l’extraction des objets fibres sous Image J....

Le critère le plus pertinent semble être le diamètre de Féret qui est défini comme étant la plus grande distance calculée sur une section d’objet. Les aires des fibres sont très variables pour permettre de discriminer les deux types de fibres. En effet, les aires calculées pour les fibres primaires sont de 280 ± 170 μm2 _{contre un diamètre de Féret calculé de 34 ±} 11 μm pour ces mêmes fibres primaires (analyse réalisée sur 61 fibres extraites par Image J à partir de trois images sources acquises au microscope confocal). Dans le cas des fibres secondaires l’aire calculée est de 95 ± 71 μm2 _{et le diamètre de Féret est de 13 ± 4μm} (analyse réalisée sur 133 fibres extraites à partir d’une image source acquise au confocal). Les fibres primaires et secondaires sont significativement différentes d’après le test de

comparaison multiple (Test de Tukey) en considérant les aires ou les diamètres de Féret (au seuil de 1%).

Ces résultats encourageants avec l’approche masque ont motivé l’exploitation de cette approche. Le diamètre de Féret est retenu comme mesure principale car cette mesure est plus lisible et que le coefficient de corrélation calculé entre les aires des fibres et le diamètre de féret est de 0,91.

L’étude préliminaire présentée précédemment a été effectuée à partir de coupes transversales de tige de chanvre cultivé en serre. L’étude des fibres in planta a été menée sur des coupes transversales d’une plante provenant du champ (entre-nœuds 2 et 3 à 30 et 40 cm). Sur une série de 10 images, 280 fibres primaires ont été extraites et le diamètre de Féret mesuré est de 34 ± 14 μm. Il est intéressant de remarquer que les conditions de culture entre la serre et le champ, n’impactent pas les tailles de fibres mesurées (test de Tukey au seuil de 1%, test de Mann et Whitney au seuil de 5%). La grande variabilité pourrait s’expliquer par le fait que les fibres dont le diamètre est le plus petit sont en fait coupées au niveau des extrémités effilées. Néanmoins, étant donné la grande longueur de ces fibres, ce point est plutôt secondaire. Une façon de pallier ce problème aurait été de réaliser des coupes sériées, toutefois l’épaisseur des coupes (40 μm) est largement inférieure à la longueur des fibres.

Un exemple d’application de cette méthode concerne les mesures des fibres de chanvre dans les sections transversales de matériaux composites (Figure 62). Les images des sections de matériaux composites sont obtenues au microscope électronique à balayage (MEB) et sont réalisées par les partenaires mécaniciens du programme CompoChanvre (LMPM) (Thèse C. Bonnafous, 2010). La mesure des diamètres de Féret sur ses sections ne peuvent être que manuelles, les images ne présentant qu’un trop faible contraste comme en témoigne l’histogramme de l’image (B, Figure 62) et le profil de niveaux de gris obtenu sur

Figure 62. Présentation de l’application de la mesure du diamètre de Féret, avec Image J, sur des sections transversales de matériaux composites chanvre / époxy. A. Section transversale du matériau composite (Image MEB acquise par les partenaires du LMPM). Le trait rouge traversant une fibre permet de tracer le profil des niveaux de gris sur ce segment (C). B. Histogramme de la répartition des niveaux de gris contenu dans l’image A. C. Profil des niveaux de gris le long du segment rouge tracé sur une fibre sur l’image A....

D’après la littérature (FNPC, Bouloc 2006), les diamètres des fibres de chanvre sont de 15 à 30 μm pour les fibres primaires et de 5 à 20 μm pour les fibres secondaires. La façon de mesurer les diamètres n’est pas précisée. Les fibres ne sont pas des objets ronds, toutefois, les mesures des cellules sont souvent réalisées en considérant le périmètre puis en calculant ensuite le diamètre circulaire équivalent. Une étude, par Charlet et al., menée en 2006 sur les fibres de lin incrustées dans les matériaux composites, a considéré un facteur de forme de circularité, 4_πS/P2 _{pour corriger cette approximation. Ce facteur est égal} à 1 pour une particule circulaire et tend vers 0 quand la particule s’allonge. Sur les fibres de lin, la valeur calculée est de 0,905. Leurs calculs leur permettent de déterminer des