Chapitre 2 : Développement et validation de méthodes analytiques pour la quantification
III.2 CLHP/SM-SM
III.2.2. b Pré-validation de la méthode de dosage par CLHP/SM-SM
La spécificité de la méthode a été vérifiée en comparant le chromatogramme obtenu lors de l’injection d’une solution de SBF à 0,5% d’HP--CD à celui obtenu pour le mélange d’aprépitant et d’étalon interne, le lopéramide. L’absence de signal correspondant à ces deux composés sur le chromatogramme de la solution de SBF à 0,5% d’HP-ß-CD a permis d’attester de la spécificité de la méthode.
La limite de quantification (LOQ) a été déterminée par injection de solutions de SBF à 0,5% d’HP--CD, contenant des concentrations décroissantes d’aprépitant. Elle est égale à 9,35.10-3 µg.L-1.
La fonction de réponse a été établie en injectant une série de solutions standards de calibration d’aprépitant de concentration allant de 5,35 µg.L-1 à 427,5 µg.L-1, et 51,3 µg.L-1en étalon interne, préparées dans la solution de SBF à 0,5% d’HP--CD. Le rapport des aires des pics de l’aprépitant sur celui du l’étalon interne (AApt/AEI) en fonction de la concentration de l’aprépitant, est reporté sur la figure II.12. Le profil obtenu a été modélisé à l’aide d’une régression polynomiale d’ordre 2, conduisant à l’équation suivante :
𝐴𝐴𝑝𝑡
𝐴𝐸𝐼 = −5,60. 10−6× 𝐶𝐴𝑝𝑡2 + 7,16. 10−3× 𝐶𝐴𝑝𝑡− 7,93. 10−3 (équation II. 10) CApt étant exprimée en µg.L-1
La valeur du coefficient de corrélation obtenue (R2 > 0,999) atteste de la validité du modèle.
Figure II.12 : Fonction de réponse pour le dosage de l’aprépitant par CLHP/SM-SM.
La détermination de la concentration de l’aprépitant dans un échantillon à doser se fera à partir du rapport AApt/AEI mesuré pour cet échantillon lors de l’analyse par CLHP/SM-SM, en résolvant cette équation du second degré à l’aide du logiciel Excel.
La justesse et la fidélité de la méthode ont été évaluées à l’aide de trois solutions standard de validation (QC) contenant l’aprépitant à des concentrations respectivement égales à 5,35, 214 et 428 µg.L-1 et 51,3 µg.L-1 d’étalon interne. Chacune de ces solutions a été préparée en triplicat, puis injectée dans le système chromatographique. Le tableau II.10 présente les résultats obtenus.
Tableau II.10 : Etude de la justesse et fidélité de la méthode.
QC [Apt] (µg.L-1) Justesse Erreur relative (%) Répétabilité CV (%) 1 5,35 -6,3 4,4 2 214 -2,0 2,8 3 428 -3,0 2,1 0,00E+00 5,00E-01 1,00E+00 1,50E+00 2,00E+00 2,50E+00 0 100 200 300 400 500 CApt (µg/L) Aapt /A EI
82 Quel que soit le niveau de concentration, l’erreur relative est inférieure à 7%. La méthode peut donc être considérée comme étant juste si l’on se fixe un seuil d’acceptabilité de 10%. Par ailleurs, les coefficients de variation mesurés sont inférieurs à 5%, ce qui reflète la répétabilité de la méthode.
IV Conclusion
Deux méthodes d’analyse orthogonales ont été développées pour doser simultanément l’Ond, l’Apt et la Dex. Ces deux méthodes ont montré leur capacité à déterminer la concentration des 3 PA dans une préparation galénique et ce avec justesse et fidélité.
Bien que la préparation de l’échantillon soit quasi équivalente dans les deux cas (une simple dilution éthanolique), la méthode UV/PLS est globalement plus rapide que la méthode CLHP (5 min versus 30 min) et sera particulièrement intéressante pour le contrôle en routine des préparations transdermiques au sein d’une Pharmacie à Usage Intérieur.
Développée avec le PLO®, cette méthode chimiométrique ne peut toutefois, pas être transposée directement lors de l’analyse d’autres véhicules transdermiques qui sont à l’étude. De plus, la méthode UV/PLS présente des seuils de quantification plus élevés que ceux obtenus en CLHP/UV, la rendant moins pertinente pour suivre la cinétique de perméation des PA à travers la peau. Ainsi, de par sa spécificité, la CLHP/UV est la méthode retenue lors de cette étude, pour contrôler la teneur des 3 PA lors de leur formulation dans les différents véhicules et d’autre part, pour évaluer le passage transmembranaire.
Enfin, le couplage d’un spectromètre de masse à la CLHP a permis de diminuer le seuil de quantification de l’aprépitant d’un facteur 105, ce qui permettra de suivre la cinétique de perméation de l’aprépitant lors des études ultérieures, en opérant dans la gamme de concentration pour laquelle la fonction de réponse a été établie.
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CHAPITRE 3 :
Evaluation in vitro des véhicules prêts à l’emploi pour
l’administration de l’aprépitant, de la dexaméthasone et de
l’ondansétron par voie transdermique.
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