Chapitre 3: Evaluation in vitro des véhicules prêts à l'emploi pour l'administration de
II.4 Etude cinétique de la perméation des PA
II.4.1 Préparation des épidermes
Les oreilles de cochons ont été gracieusement fournies par l’animalerie du CHRU de Lille et les Abattoirs de Valenciennes dont l’obtention et l’utilisation ont fait l’objet d’une autorisation préfectorale. L’acheminement des oreilles a été réalisé par nos soins dans les deux heures qui ont suivi l’euthanasie, dans une glacière contenant des pains de glace. Dès réception, les oreilles ont été lavées à grande eau et tamponnées avec des compresses pour enlever le sang résiduel. Les oreilles ont ensuite été observées minutieusement afin d’exclure les parties altérées par d’éventuels érythèmes ou égratignures. La peau a ensuite été séparée du cartilage à l’aide d’un scalpel équipé d’une lame de 23 mm.
Les quelques soies présentes sur la face dorsale de l’oreille ont été délicatement rasées puis retirées de la peau préalablement humidifiée par du sérum physiologique. La peau a été séchée avant d’être stockée entre deux feuilles d’aluminium à -20°C pour une durée maximale d’un mois. Le processus d’épidermisation a été effectué sur une peau décongelée à température ambiante. La séparation épidermique a été réalisée par un procédé thermique. Pour ce faire, une section de peau d’une dizaine de cm2 est immergée pendant 60 secondes dans un bain-marie d’eau distillée thermostaté à 60°C. La peau est ensuite retirée du bain-marie et humidifiée par du sérum physiologique avant d’être tendue à l’aide d’aiguilles sur une plaque de polystyrène. L’épiderme a délicatement été séparé du derme à l’aide d’une pince brucelle courbée puis étalée sur une feuille d’aluminium, stratum corneum côté air ambiant. Des morceaux de 2 cm2 ont ensuite été coupés au scalpel pour s’adapter à la géométrie des cellules de Franz. La figure III.3 présente les différentes étapes requises pour l’obtention des membranes épidermiques.
Figure III.3 : Procédure de préparation des épidermes à partir des faces dorsales de peau d’oreille de cochon.
II.4.2 Vérification de l’intégrité des épidermes
Avant d’étudier la perméation des formulations sur les peaux épidermées d’oreille de cochon, il est nécessaire de vérifier que ces membranes biologiques n’aient pas été endommagées lors du procédé d’épidermisation. Pour évaluer l’intégrité des épidermes, une mesure de l’impédance transépidermique a été réalisée sur chacun d’eux. Pour ce faire, l’épiderme est clampé sur la cellule de Franz (face extérieure du SC vers le haut) entre les compartiments donneur et receveur remplis d’un volume constant de solution saline physiologique de NaCl à 0,9% préalablement placée 15 min aux US. Deux électrodes en platine sont ensuite immergées, une dans le compartiment donneur et une deuxième dans le compartiment receveur via le bras de prélèvement. Ces deux électrodes placées de part et d’autre de la membrane, à une distance prédéfinie, sont reliées entre elles par un circuit électrique composé d‘un ampèremètre, mesurant le courant en μA, d’un voltmètre, mesurant la tension en mV et d’un générateur de basses fréquences, délivrant une tension sinusoïdale de 1 V à une fréquence de 100 Hz.
A partir de la relation Z=U/I, où U est la tension efficace et I l’intensité efficace du courant mesuré, l’impédance Z du circuit est déduite à partir de cette relation. Les membranes pour lesquelles l’impédance totale du circuit est inférieure à 3,5 kΩ sont écartées.
II.4.3 Protocole expérimental de la cinétique de perméation
Le compartiment receveur de la cellule de Franz est tout d’abord rempli d’une solution de SBF (pH = 7,4) contenant 0,5% d’HP-β-CD. L’épiderme est placé à l’interface des deux compartiments qui sont ensuite maintenus avec une pince. La cinétique de perméation débute dès le dépôt de 200 mg de la forme transdermique à étudier sur l’épiderme, dans le compartiment donneur. Afin d’évaluer la quantité de principe actif ayant traversée l’épiderme, des prélèvements de 200 µL du milieu receveur, sont réalisés à 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2,5 ; 4 ; 5,5 ; 7 ; 16 ; 19 ; 23 et 40 h. Après chaque
95 fraîche de SBF additionnée de 0,5% HP-β-CD et thermostatée à 32°C. Les différents prélèvements sont ensuite analysés par CLHP/UV (dexaméthasone et ondansétron) ou par CLHP/SM-SM (aprépitant).
II.4.4 Dosage
La concentration en dexaméthasone et en ondansétron dans chacun des prélèvements est déterminée en CLHP/UV par étalonnage interne en un point. La préparation des standards de calibration est réalisée selon le même protocole que celui décrit dans le paragraphe II.3.5 de ce
chapitre. La détermination de l’aprépitant a été réalisée en CLHP/SM-SM à partir de la courbe d’étalonnage présentée dans le chapitre II, après addition de 5 µL d’une solution d’étalon interne à 513 mg.L-1 dans 45 µL de chacun des échantillons.
II.4.5 Exploitation des résultats
II.4.5.a Détermination des quantités cumulées
A partir des résultats de quantification obtenus par CLHP/UV (pour la dexaméthasone et l’ondansétron) ou par CLHP/SM-SM (pour l’aprépitant), la quantité cumulée de chaque principe actif (Qcum) dans le milieu receveur, a été calculée selon l’équation III.1 décrite précédemment.
II.4.5.b Détermination des paramètres cinétiques
L’évolution de Qcum en fonction du temps a ensuite été tracée (figure III.4).
Figure III.4 : Quantité cumulée en fonction du temps : détermination graphique des paramètres cinétiques. 0 20 40 60 80 100 120 0 20 40 60 80 Temps (h) Q cum (µ g) Lag-time Flux à l'équilibre Qcum = at+b Temps de latence
A partir de ce profil, il est possible d’évaluer le flux J (µg.cm-2.h-1), la constante de perméabilité Kp (cm.h-1) et le temps de latence Tl (h).
Le Flux J (µg.cm-2.h-1) représente la vitesse de perméation du principe actif lorsque l’équilibre du gradient de concentration est atteint. Il correspond à la pente 𝑎 (µg.h-1) de la droite de régression tracée sur la portion linéaire de la cinétique de perméation, divisée par la surface de la membrane S (cm2) (Baert, 2011).
𝐽 =
𝑎𝑆 (équation III.4) La constante de perméabilité, 𝐾𝑝 (cm.h-1), est ensuite calculée selon la formule suivante (Korinth, 2005) :𝐾
𝑝=
𝐽𝐶𝑜 (équation III.5)
où 𝐶𝑜est la concentration en principe actif dans la formulation galénique (mg.L-1).
Le temps de latence 𝑇𝑙 (h) appelé plus communément le « lag time », est le temps nécessaire à l’établissement de l’équilibre du gradient de concentration en principe actif dans la peau. Il correspond à l’intersection de la droite décrite précédemment avec l’axe des abscisses (y = 0) (Italo Giannola, 2007). Ainsi, 𝑇𝑙 est obtenu à partir de la relation suivante :
𝑇
𝑙=
|𝑏|𝑎 (équation III.6)
avec 𝑏, l’ordonnée à l’origine de la droite et 𝑎, le coefficient directeur de la droite.
II.4.5.c Analyses statistiques
Un test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post hoc de Dunn a été réalisé afin de comparer les valeurs des flux et des quantités de PA diffusées à 40 h, à l’aide du logiciel XLSTAT. Les p-values inférieures à 0,05 indiquent des différences significatives.
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