Chapitre 3: Evaluation in vitro des véhicules prêts à l'emploi pour l'administration de
III.4 Etude cinétique de la perméation des principes actifs
III.4.3. b Choix des paramètres de mesure
La première étape de ce travail a porté sur la détermination de la fréquence et de la tension alternative à utiliser afin de mesurer l’impédance des explants d’épiderme. Elle doit être telle que lorsque l’intégrité de la peau varie, l’impédance totale mesurée qui résulte de l’impédance de la solution saline et de celle de l’épiderme, soit modifiée significativement. Dans ces conditions, l’impédance totale pourra servir de facteur discriminant pour s’assurer de l’intégrité de la peau.
La seconde étape de ce travail a porté sur la détermination d’une valeur seuil d’impédance pouvant servir de référence lors du choix des membranes utilisées lors de l’évaluation de la cinétique de perméation des principes actifs.
Validation du choix de la fréquence
Des mesures d’impédance ont tout d’abord été réalisées à l’aide de la cellule de Franz remplie de solution saline, en présence ou non de l’épiderme, en utilisant le montage présenté sur la figure III.14 et en modulant la tension de sortie du générateur basses fréquences entre 100 mV et 1 V. Ces
Générateur de basses fréquences
Ampèremètre
NaCl 0,9% thermostaté à 32°C
Electrode de platine
Epiderme de peau de cochon
Voltmètre
Résistance de protection
premiers essais ont été menés à une fréquence de 100 Hz recommandée par l’OCDE pour l’évaluation de l’intégrité de la peau via des mesures d’impédance.
Ainsi, lorsque la cellule de Franz ne contient que la solution saline, si l’on module la tension de sortie du GBF, la fonction qui relie le courant circulant à travers la peau et la tension mesurée aux bornes des électrodes est linéaire (R2= 0,9997 ; U = 2,4129.103 I). Il est de même lorsque l’épiderme est inséré entre les deux compartiments remplis de solution saline (R2= 0,9995 ; U = 496,4 I). Ceci atteste du fait que la loi d’Ohm généralisée est respectée dans les deux cas et donc que l’impédance de la solution saline seule ou en contact de l’épiderme est constante dans ces conditions de mesure quelle que soit la tension de sortie du GBF.
Ce premier résultat a donc permis de valider le protocole expérimental utilisé pour mesurer l’impédance.
Dans le but de comparer l’impédance de l’épiderme par rapport à celle de la solution saline afin de déterminer si l’impédance totale mesurée reflète l’impédance de l’épiderme, mais aussi son intégrité, un modèle a été mis en place. Celui-ci est présenté sur la figure III.15.
Figure III.15 : Schéma électrique du système de mesure de l’impédance de l’épiderme.
GBF (fréquence de 100 Hz, tension de sortie de 1 V) ; Rp et Cp, la résistance et la capacité de la peau ; Rs et Cs, la résistance et la capacité de la solution de NaCl à 0,9%.
Dans ce modèle, la solution saline et la peau sont schématisées par un montage électrique simplifié avec, une résistance et un condensateur qui reflètent l’impédance propre de chacune dans un circuit électrique soumis à une tension alternative à basses fréquences (Lai, 1998). Celles-ci sont
A GBF Rs Cs Cp 1 kΩ Rp
U
T V R123 A partir de ce modèle et des impédances mesurées à deux fréquences distinctes (90 et 100 Hz), la résistance (Rs) et la capacité (Cs) de la solution de NaCl à 0,9%, puis la résistance (Rp) et la capacité de la peau(Cp) ont été calculées.
Pour cela, on considère que lorsqu’une résistance est placée en série avec un condensateur, l’impédance résultante est définie par l’équation III.9 :
𝑍 = √𝑅2+ ( 1
2𝜋𝑓𝐶)2 (équation III.9) avec 2𝜋𝑓𝐶1 = 𝑋𝐶 (équation III.10)
où Z est l’impédance (), R la résistance (), f la fréquence (Hz), C la capacité (F) et Xc la réactance capacitive ().
Il est possible d’écrire un système de deux équations à deux inconnues, dont la résolution permet alors de déterminer la résistance, R, et la capacité, C, du système considéré. Dans le cas de la solution saline, le système d’équations est le suivant :
𝑍𝑠(90 𝐻𝑧)= √𝑅𝑠2+ ( 1
2𝜋.90.𝐶𝑠)2 (équation III.11)
𝑍𝑠(100 𝐻𝑧) = √𝑅𝑠2+ (2𝜋.100.𝐶1
𝑠)2 (équation III.12)
Où 𝑍𝑠 est l’impédance de la solution.
Dans la gamme de fréquence utilisée, une résistance Rs de 426 et une capacité de 8,9.10-6 F ont ainsi été obtenues. Cette capacité correspond à une réactance capacitive Xcs de 179 pour une fréquence de 100 Hz.
Une approche similaire a été utilisée pour le système épiderme-solution saline afin de calculer les résistances totales RT et la capacité totale CT de ce système ; A 100 Hz, une résistance RT de 4234 et une réactance capacitive XT de 497 ont ainsi été obtenues.
Compte tenu du modèle proposé, à une fréquence donnée x en Hz, la résistance totale RT du circuit et la réactance capacitive totale XT sont respectivement définies par les équations III.13 et III.14 :
𝑅𝑇(𝑥 𝐻𝑧)=𝑅𝑠(𝑥 𝐻𝑧 )+𝑅𝑝(𝑥 𝐻𝑧 ) (équation III.13)
𝑋𝑇(𝑥 𝐻𝑧)=𝑋𝑠(𝑥 𝐻𝑧 )+𝑋𝑝(𝑥 𝐻𝑧 ) (équation III.14)
Il est donc possible de calculer 𝑅𝑝(𝑥 𝐻𝑧 )et 𝑋𝑝(𝑥 𝐻𝑧 ) connaissant 𝑅𝑇(𝑥 𝐻𝑧),𝑋𝑇(𝑥 𝐻𝑧), 𝑅𝑠(𝑥 𝐻𝑧 ) et 𝑋𝑠(𝑥 𝐻𝑧 ).
Ainsi à 100 Hz, l’impédance propre de la peau est donc de 3821 et celle de la solution est de 462 . La figure III.16 correspond à la représentation de Fresnel des impédances de la solution saline (bleu) et de l’épiderme (vert) et totale (rouge). Chaque composante, à savoir résistance (R) et réactance capacitive (Xc), est représentée par un vecteur de Fresnel.
Figure III.16 : Construction de Fresnel des résistances (R), des réactances capacitives (X) et des impédances (Z) de la solution saline (bleu), de l’épiderme (vert) et totale (rouge).
On peut noter que dans nos conditions de mesure (fréquence de 100 Hz, tension en sortie du GBF de 1 V), l’impédance de la solution est négligeable par rapport à celle la peau et que la partie résistive (R) est prépondérante sur la partie capacitive (X). Dans ces conditions, il sera possible de négliger l’impédance de la solution saline lors des mesures de l’impédance du système épiderme-solution saline, c’est-à-dire de considérer que l’impédance mesurée reflète directement l’impédance de l’épiderme.
Pour chaque fréquence étudiée, afin de vérifier la qualité du modèle, l’impédance totale a été recalculée à partir des résistances et réactances capacitives calculées à l’aide du modèle. Elle a ensuite été comparée à la valeur expérimentale par un calcul du biais selon l’équation III.15 :
𝐵𝑖𝑎𝑖𝑠 (%) = 𝑍𝑐𝑎𝑙𝑐𝑢𝑙é𝑒−𝑍𝑒𝑥𝑝é𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙𝑒 𝑍𝑒𝑥𝑝é𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙𝑒 × 100 (équation III.15) Rs Xs Zs Rp Xp Zp XT RT ZT
125 Ainsi, la qualité d’ajustement du modèle a été attestée par des biais inférieurs à 1% pour des fréquences de 90 et 100 Hz pour la solution saline et l’épiderme. Ceci valide le modèle proposé et les conclusions qui en sont tirées.
Détermination du seuil d’acceptation et de la sensibilité
Après avoir validé le modèle à une fréquence optimale, la sensibilité de la méthode et le seuil d’acceptation des impédances des membranes épidermiques ont été déterminées. Pour ce faire, trois peaux ont été décongelées à température ambiante puis épidermées selon le protocole détaillé précédemment. Une observation au microscope optique avec un grossissement de 100 a ensuite été réalisée afin de s’assurer qu’aucune micro-incision n’ait été induite lors du processus d’épidermisation. Les impédances de ces trois membranes épidermiques ont ensuite était mesurées selon le protocole détaillé ci-dessus. Des trous répétés à différents endroits de la membrane ont ensuite été réalisés à l’aide d’une aiguille à tête d’épingle afin de mesurer l’évolution de l’impédance en fonction de son état endommagé. La figure III.17 présente les variations de l’impédance en fonction du nombre de trous réalisés.
Figure III.17 : Influence du nombre de trous sur l’impédance de l’épiderme.
L’impédance mesurée sur l’épiderme obtenue par la méthode thermique est d’environ 3,7 k ; elle présente une bonne répétabilité (CV = 3%). La réalisation d’un premier trou entraine une diminution importante de l’impédance (35%). Lorsque le nombre de trous augmente, l’impédance
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 0 1 2 3 4 5 6 7 Z ( k ) Nombre de trous
diminue progressivement jusqu’à atteindre une valeur seuil d’environ 1,3 k . Ces résultats attestent de la sensibilité de la méthode.
Ainsi, le seuil d’acceptabilité de l’impédance totale a été fixé à 3,5 k. Le rapport de l’impédance totale sur la surface d’échange de la membrane doit donc être supérieur à 5,5 k.cm-2
pour qu’une membrane puisse être retenue.