Les données macroscopiques montrent que si les souris Tg+ sont naturellement plus petites que les souris Tg-, leurs organes ont des poids comparables. Par ailleurs, l’infection induit de la même façon chez les deux groupes de souris une perte de poids corporel au moment des plus fortes parasitémies.
Les souris Tg+ parasitées présentent au plus fort de l’infection une splénomégalie importante et une légère augmentation du poids hépatique. L’atteinte hépatique tend à se résorber après le pic de crise, mais pas la splénomégalie, qui augmente encore. Ce schéma est globalement le même que celui qui est observé chez les souris Tg- infectées. Chez les deux types de souris, le poids des reins tend peut-être à augmenter au cours de l’infection, mais aucune différence statistiquement significative ne vient soutenir cette observation. Il faut noter que la néphromégalie est connue dans certains cas de paludisme aviaire mais n’a jamais été observée dans les modèles murins.
Les résultats de l’analyse histopathologique comparative des organes chez les souris Tg+ et Tg- infectées par P. c. chabaudi 864VD ont permis de mettre en évidence que dans les deux cas, les poumons et les reins sont peu touchés par l’infection. En revanche, le foie et la rate présentent un fort taux de lésions chez les deux types de souris. Ces lésions sont de même nature, mais leur intensité et/ou leur précocité diffèrent entre les souris Tg- et Tg+.
Plus en détail, il ressort que :
(1) Les souris Tg+, comme les souris Tg-, présentent des lésions pulmonaires minimes avec quelques rares infiltrats périvasculaires au 8ème jour de l’infection, qui ne sont plus observés par la suite ;
(2) Des lésions rénales légères (inflitrations périvasculaires) apparaissent tardivement chez les deux types de souris ;
(3) Dans le foie, de nombreuses lésions apparaissent à J14 p.i., conjointement à l’hépatomégalie. Ces lésions sont les mêmes chez les deux génotypes murins : un envahissement diffus des sinusoïdes par de l’EMH (cellules indifférenciées) et des cellules inflammatoires, une répartition homogène de pigments d’hémozoïne dans tout le parenchyme hépatique, des zones nécrotiques à préférence sous-capsulaire entourées d’un infiltrat inflammatoire. La différence liée au génotype s’observe à J21 p.i avec chez les Tg- une bonne récupération tissulaire, seules 2 souris sur 6 présentent encore de rares foyers d’EMH diffus dans le tissu ; tandis que chez les Tg+, 2 souris sur 5 montrent encore un niveau sévère de lésions, avec des zones nettes d’infiltration et d’inflammation. Ces observations laissent penser que les souris Tg+ récupèrent moins vite des atteintes au foie liées à l’infection par Plasmodium que les souris Tg-. La présence de la hGIIA dans le foie des souris Tg+ a été confirmée par immunomarquage. Les images ont permis de visualiser la dispersion hétérogène de l’enzyme dans le foie à J0, J8 p.i. Puis, à J14 p.i., le marquage se concentre préférentiellement au niveau des veines centro-lobulaires et de foyers nécrotiques. Le marquage des zones de nécrose est toutefois douteux dans la mesure où les souris Tg- ont présenté le même marquage en absence de hGIIA, ce qui suggère une absence de spécificité du marquage. Au même temps, à J14 p.i., on mesure une augmentation des transcrits du gène de la hGIIA dans le foie. Ceci indique que des cellules présentes dans les zones de nécrose (?) et au niveau des veines
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lobulaires pourraient être sollicitées et sécréter plus de hGIIA. Le niveau d’ARNm baisse à J21 p.i., en parallèle avec un début de régénération du tissu hépatique. La question se pose donc de savoir si la présence de l’enzyme pourrait freiner la régénération de l’organe, qui, à J21 p.i., est moins avancée que chez les souris Tg- sans hGIIA. (4) Dans la rate, parallèlement à la splénomégalie, on observe à J14 p.i., chez toutes les souris Tg+, une désorganisation de l’architecture splénique avec effacement des limites entre pulpe blanche et pulpe rouge, désorganisation qui persiste encore au 21ème jour de l’infection chez 2 souris sur 5, tandis que ce phénotype ne s’observe que chez la moitié des souris et uniquement à J21 p.i. chez les souris Tg-. L’analyse immunohistochimique des coupes de rate aux différents temps de l’infection montre que la désorganisation du tissu splénique chez les souris Tg- correspond à une hyperplasie de la pulpe rouge et de la pulpe blanche avec prolifération des LB, alors que chez les souris Tg+, la multiplication cellulaire serait due préférentiellement à de l’EMH. L’analyse de la distribution des LT et B au sein des lésions spléniques indique donc que les phénomènes de prolifération cellulaire pourraient impliquer des cellules différentes chez les souris Tg- et Tg+.
Par ailleurs, la hGIIA n’a pas été décelée par IHC dans la rate des souris Tg+ infectées, ce qui indique que la protéine est absente ou en quantité trop faible pour être détectée, et suggère que la désorganisation particulière de la rate chez les Tg+, en particulier l’EMH, ne serait pas liée à la présence physique de l’enzyme dans l’organe.
Enfin, ni le rein ni le poumon n’ont montré d’atteintes significatives lors de l’infection par P. c. chabaudi 864VD, tout au moins dans les limites de temps de nos expériences. Il est toutefois intéressant de noter que la hGIIA a été détectée dans des régions très spécifiques du rein : au niveau de la capsule de Bowman, des cellules des tubes contournés proximaux et de l’urothélium. La distribution de la protéine et l’intensité du marquage ne semblent pas modifiées par l’infection (J14 p.i. vs J0).
Activité enzymatique plasmatique en relation avec l’expression de la hGIIA dans les organes et tissus
Nous avons vu que l’activité enzymatique de type sPLA2 mesurée dans le plasma des souris Tg+ parasitées augmente avec la parasitémie jusqu’à J14 p.i., puis diminue brutalement dans les deux jours qui suivent, en même temps que la parasitémie baisse. Le niveau de l’activité enzymatique n’est pas directement assimilable à la quantité de protéine ou d’ARNm : la présence d’inhibiteurs ou d’activateurs de l’enzyme peuvent moduler son activité sans que la quantité d’enzyme change. De même, la protéine peut être stockée et libérée à la demande sans qu’il soit besoin d’augmenter la quantité d’ARNm, ou c’est l’ARN qui peut être stocké et traduit à la demande. Il est donc difficile ici de savoir quel phénomène rend compte de l’augmentation de l’activité plasmatique, ou de sa diminution.
Les résultats obtenus par l’analyse quantitative de l’ARNm de la hGIIA dans les organes sont encore préliminaires, dans la mesure où ils ont été établis à partir d’effectifs trop petits pour permettre une analyse statistique. L’analyse d’un nombre plus grand d’échantillons sera faite à partir des organes congelés, actuellement stokés au laboratoire. La discussion qui suit reste donc spéculative.
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Le foie est, parmi les organes et tissu analysés, le seul à montrer une augmentation de la quantité d’ARN entre J8 et J14 p.i.. Il pourrait donc être en partie responsable de l’augmentation d’activité enzymatique dans le plasma, par une augmentation de la sécrétion de sPLA2 dans le sang. Toutefois, on ne peut pas exclure que d’autres organes que ceux étudiés ici pourraient surexprimer la hGIIA au cours de l’infection. La rate et les cellules du sang voient leur quantité d’ARNm diminuer au cours de l’infection, ce qui les rend peu susceptibles de rendre compte de l’augmentation d’activité. En revanche, la diminution de l’activité plasmatique après le pic de parasitémie est en accord avec le faible niveau d’ARNm mesuré à J21 p.i. dans les trois tissus étudiés : le foie, la rate et les cellules du sang.
Il semble clair aussi que dans les tissus qui ont pu être analysés, l’infection par Plasmodium ne sollicite pas l’expression des sPLA2 murines IIF, III, V et X. Au contraire, on constate une diminution de la quantité d’ARNm des seules deux sPLA2 (mGIIF et mGV) qui ont pu être détectées dans la rate. On retrouve donc le même profil quantitatif que celui de l’ARNm de la hGIIA dans la rate des souris Tg+ infectées. La question se pose de savoir si la diminution générale des ARNm des sPLA2 dans la rate est un phénomène actif en lien avec la physiopathologie de l’infection, ou une conséquence « collatérale » de la splénomégalie. En effet, dans la deuxième situation, dans l’hypothèse où les cellules néo-formées responsables de l’augmentation du volume de la rate n’exprimeraient pas le gène de la hGIIA, on observerait une diminution de la quantité d’ARNm mesuré.
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PARTIE 3 : Etude du mécanisme d’action anti-Plasmodium de la
hGIIA
Nous avons montré que la hGIIA recombinante est capable d’induire une baisse de parasitémie lorsqu’elle est injectée à des souris WT infectées. Cependant, le(s) mécanisme(s) d’action antiparasitaire de l’enzyme in vivo est (sont) inconnu(s). Une partie du travail de thèse a été consacré à l’étude de ce(s) mécanisme(s).
Nous avons choisi deux voies d’approche pour essayer de décrypter le(s) mécanisme(s) d’action de la hGIIA. La première approche s’est appuyée sur des données récentes obtenues in vitro, montrant que la hGIIA est capable d’inhiber la croissance de P. falciparum en culture par un mécanisme indirect mettant en jeu l’hydrolyse des lipoprotéines plasmatiques contenues dans le milieu de culture. Dans la deuxième approche, nous nous sommes intéressés aux propriétés de médiateur de l’immunité de la hGIIA, en supposant que la présence de l’enzyme chez la souris transgénique pouvait modifier la réponse immunitaire de la souris vis-à-vis du parasite.