Plasmides

a) Plasmides utilisés pour les clonages

pDONR207 : Le plasmide pDONR207 de 5585 pb confère la résistance au chloramphénicol

et à la gentamycine. C’est un plasmide donneur pour le clonage par le système Gateway® qui possèdeles sites de recombinaison attP. Entre les sites de recombinaison se trouvent le gène de résistance au chloramphénicol et le gène suicide ccdB qui code une protéine bloquant la croissance de la bactérie par son interaction avec la gyrase à ADN. Ce plasmide a été utilisé pour le clonage des phases ouvertes de lecture (ORF) des ADNc codant la GO1 de Z. mays, dans le plasmide pK7WG-proSHMT1.

Matériel et méthodes

132

pENTR2B : Le plasmide pENTR2B de 3800 pb confère la résistance à la kanamycine. C’est

un plasmide entrant pour le clonage par le système Gateway® qui possède les sites de recombinaison attL. Entre les sites de recombinaison se trouvent deux régions de clonage multiple, entre lesquelles se trouve le gène suicide ccdB. Ce plasmide a été utilisé pour le clonage du gène amiRGOX1/2 dans le plasmide pAlligator2.

pGEM-T Easy® : Le plasmide pGEM-T Easy® de 3015 pb confère la résistance à l’ampicilline. Il possède un site de clonage multiple introduit en phase dans le gène lacZ codant une β–galactosidase. Lors du clonage, ce gène sera interrompu par la présence de l’insert. L’addition dans le milieu d’un analogue du galactose, le X-gal, dont l’hydrolyse conduit à la formation d’un produit bleu, permet de sélectionner les colonies recombinantes qui resteront blanches (sélection blanc/bleu). Le pGEM-T Easy® est commercialisé sous forme linéaire avec les extrémités 3’ portant une thymidine sortante. Elles serviront au clonage de produits PCR obtenus avec la Taq polymérase, qui rajoute une adénosine sortante à chaque extrémité 5’. Ce plasmide a été utilisé pour sous-cloner la séquence du promoteur

SMHT1 vers le plasmide pK7WG et les ORF des ADNc desgènes ZmGO1 et AtGOX1 dans le plasmide pET28a.

pRS300miR319a : Le plasmide pRS300 de 3369 pb confère la résistance à l’ampicilline. Il

possède un site de clonage multiple, à l’intérieur duquel a été inséré l’ORF de l’ADNc pour le gène miR319a. Il offre la possibilité de modifier la séquence du microARN par de multiples PCR selon le protocole de Schwab et al., (2006). Ce plasmide a été utilisé pour construire un gène codant un microARN artificiel pouvant éteindre spécifiquement et simultanément l’expression des gènes AtGOX1 et AtGOX2 chez A. thaliana.

b) Plasmides utilisés pour l’expression de protéines recombinantes

pET28a : Le plasmide pET28a de 5369 pb confère la résistance à la kanamycine. Il possède

un site de clonage multiple, avec en amont et en aval, une séquence codante une étiquette histidine. Il y a une séquence lacO entre le promoteur T7 et le rbs (« ribosome binding site »). Ce plasmide contient aussi le gène LacI. Le promoteur T7 permet d’induire la production de protéines recombinantes avec une étiquette histidine dans des bactéries contenant l’ARN polymérase du bactériophage T7 (par exemple BL21(DE3)). Cette induction se fait avec un analogue du lactose, l’Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG), qui va interagir avec la protéine dérivant du gène LacI. Cette protéine se fixe sur la séquence LacO en l’absence de

lactose et elle empêche la transcription du gène (système de l’opéron lactose chez la bactérie). L’interaction lactose-protéine LacI permet de lever cette répression, et donc d’induire la transcription de l’ADN d’intérêt. Ce plasmide a été utilisé pour la production des GOX recombinantes avec une étiquette histidine en position N-terminale.

pET28a-AtGOX2 : Ce plasmide correspond au pET28a dans lequel a été inséré l’ORF de

l’ADNc codant la protéine GOX2 d’A. thaliana, afin de produire la protéine recombinante avec une étiquette histidine en position N-terminale chez E. coli. Il a été fourni par Martin Hägemann (Hackenberg et al., 2011).

pET28a-AtGOX1 : Ce plasmide correspond au pET28a dans lequel a été inséré l’ORF de

l’ADNc codant la protéine GOX1 d’A. thaliana, afin de produire la protéine recombinante avec une étiquette histidine en position N-terminale chez E. coli. Il a été obtenu au cours de cette thèse (voir la section clonage correspondante).

pET28a-ZmGO1 : Ce plasmide correspond au pET28a dans lequel a été inséré l’ORF de

l’ADNc codant la protéine GO1 de Z. mays, afin de produire la protéine recombinante avec une étiquette histidine en position N-terminale chez E.coli. Il a été obtenu au cours de cette thèse (voir la section clonage correspondante).

pAlligator2 : Le plasmide pAlligator2 de 11 025 pb confère la résistance au chloramphénicol

et à la spectinomycine. C’est un plasmide accepteur pour le clonage par le système Gateway®. Il possède un site multiple de clonage, ainsi que le gène ccdB qui code une protéine bloquant la croissance de la bactérie par interaction avec la gyrase à ADN. Le site de clonage multiple ainsi que le gène de résistance au chloramphénicol et le gène ccdB sont encadrés par des sites

attR, qui permettent de réaliser une recombinaison avec des fragments d’ADN possédant des

sites attL, selon le système Gateway®. En amont d’un site de recombinaison se trouve un promoteur 35S CaMV (Cauliflower Mosaïc Virus), permettant d’exprimer l’ADN d’intérêt chez les plantes. Ce plasmide contient aussi de l’ADN codant la « Green Fluorescent Protein » (GFP) sous le contrôle d’un promoteur At2S3 s’exprimant spécifiquement dans l’enveloppe de la graine. Ceci permet de sélectionner les graines de plantes transformées avec ce plasmide par observation de la fluorescence émise par la GFP. Ce plasmide a été utilisé pour générer la lignée amiRgox1/2.

Matériel et méthodes

134

pAlligator2-amiRGOX1/2 : Ce plasmide correspond au plasmide pAlligator2 dans lequel a

été inséré l’ORF de l’ADNc du miR319a modifié afin de produire un microARN pouvant cibler spécifiquement les ARNm de GOX1 et de GOX2 d’A. thaliana. Ce plasmide a été utilisé pour la transformation d’A. thaliana par agro-infection pour générer des lignées

amiRgox1/2 avec une faible activité GOX foliaire(voir la section clonage correspondante).

pK7WG : Le plasmide pK7WG de 10167 bp confère la résistance au chloramphénicol chez les bactéries. Il possède le gène suicide ccdB. Les deux gènes (ccdB et gène de résistance au chloramphénicol) sont entourés par les sites de recombinaison attR qui seront utilisés pour le clonage par le système Gateway®. Ce plasmide a été utilisé pour la transformation de la lignée

amiRgox1/2 par A. tumefaciens, dans le cadre de la complémentation de cette lignée.

pK7WG-proSHMT1::ZmGO1: Ce plasmide correspond au plasmide pK7WG auquel a été

rajouté un fragment de 1 kb de la séquence promotrice du gène SHMT1 d’A. thaliana (voir Voll et al., 2005) ainsi que l’ORF de l’ADNc codant la protéine GO1 de Z. mays. Il a été utilisé pour complémenter la lignée amiRgox1/2 d’A. thaliana. Il a été obtenu au cours de cette thèse et la stratégie de clonage sera décrite dans la section clonage correspondante.