►Dans l’hypothèse de l’étude de passage intestinal ▪ Animal : rat
▪ Préparation de l’animal
Le prélèvement de fragment intestinal s’effectue sur un animal nourrit ou à jeun, dans ce dernier cas, l’animal doit être mis à jeun au moins 18h avant l’expérimentation.
▪ Le jour de l’expérimenttion
L’animal est sacrifié après anesthésie selon les règles éthiques en vigueur. - anesthésie par injection parentérale (Ex : Pentobarbital sodique à 6% ou tous
autres produits anesthésiques autorisés)
- anesthésie volatils par inhalation (EX : L’isoflurane, CO2…)
Les animaux dont la masse musculaire est faibles (rongeurs de poids inférieur à 250g peuvent être sacrifiés par dislocation cervicale)
Etude de perméation :
Appliquer le protocole de montage des tissus en chambre d’Ussing décrit précédemment.
►Prélèvement des solutions à analyser
Lorsque les paramètres électriques sont stables (état stationnaire, 30 min au moins après le montage), les composés à tester sont placés dans les compartiments muqueux ou séreux selon le sens du flux que l’on souhaite évaluer.
►Témoin négatif
Il est nécessaire de prélever une quantité déterminée du liquide dans le compartiment receveur pour servir de témoin négatif au moment de l’analyse. Ceci est d’autant plus important lorsque le produit à tester est de nature fluorescente. La quantité prélevée est remplacée par la même quantité du liquide à 37°C.
175
►Témoin positif
L’on peut prélever si nécessaire une quantité bien déterminée du liquide contenant le composé à tester dans le compartiment donneur 1 minute après son introduction. Le but est de vérifier les imprécisions liées à la concentration du composé à tester au temps Zéro et d’y apporter les correctifs nécessaires par compensation des imprécisions dans le volume du compartiment donneur.
►Prélèvement des échantillons à analyser
L’expérimentateur détermine le temps de prélèvement des échantillons dans le compartiment receveur selon que le flux membranaire est rapide ou non. Exemple du temps de prélèvement (0, 30, 60…) pour des flux lents.
Pour les composés dont le flux est rapide, il est impératif de réduire l’intervalle de temps de prélèvement afin d’obtenir un bon profil de courbe de perméation. (Ex. 0, 5, 15, 30, 60…)
►Prélèvement sans compensation du fluide :
Le total de volume prélevé dans le compartiment receveur ne doit pas dépasser 25% du volume total. Ceci a pour but d’éviter un déséquilibre osmotique favorisant le passage dans le sens du prélèvement.
►Prélèvement avec compensation du fluide
Le volume de l’échantillon prélevé est remplacé par le même volume du liquide de survie utilisé dans le compartiment où est prélevé l’échantillon, à 37°C.
►Enregistrement des paramètres électriques
L’intensité du courant de court-circuit (Isc en µA) et de la différence de potentiel (ddp en mV) est relevée à T0 puis T30 correspondant au temps d’équilibrage ensuite, toutes les 30 minutes (0, 30, 60, 90…)
Le courant de court-circuit (Isc) et la différence de potentiel ddp permettent de déterminer la résistance transmembranaire Rt ou la conductance Gt inverse de la résistance.
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▪ Le Flux
Le flux est la quantité du produit en nanomoles qui est passé à travers une membrane de 1cm2 en une heure
▪ J = (dQ /dt. S)
Avec dQ= Qt2-Qt1 et dt= t2-t1
Où :
Qt1 : Quantité de produit présent au temps t1 dans le compartiment récepteur (en mmole)
Qt2 : Quantité de produit présent au temps t2 dans le compartiment récepteur (en mmole)
S : surface de la partie du tissu exposé au passage du produit (en cm2) t1 : temps de départ de la mesure de flux (en heure)
t2 : temps de fin de mesure du flux (en heure) Le flux est exprimé en mmole/Cm2.h-1
Calcul de la perméabilité apparente
Le flux est une fonction de la concentration en produit dans le milieu donneur.
Pour pouvoir comparer les résultats entre les molécules, il faut s’affranchir de la valeur de la concentration. On calcul alors la perméabilité du tissu pour une molécule donnée.
Où :
Papp : Perméabilité du tissu pour la molécule (en cm/h) J : Flux de la molécule (en mmol/cm2.h-1)
C : Concentration en produit dans le milieu donneur (en mmol/l) Papp est exprimé en cm/s.
177
►
Paramètres de viabilité en Chambre de perméation d’UssingLes paramètres de viabilité sont vérifiés en temps réel en mesurant les paramètres électriques (Polentarruti et al., 1999), ainsi comme décrit précédemment et pour rappel, la différence de potentiel (ddp) reflète le gradient de tension du produit par le tissu, le courant de court-circuit (Isc) reflète les flux ioniques à travers le tissu, la résistance (R) ou son réciproque le conductance (G) reflète l’intégrité des tissus
Vérification de la fonctionnalité des transporteurs
A la fin de l’expérience, la viabilité physique et fonctionnelle du tissu épithélial est vérifiée par ajout dans les compartiments donneur ou receveur de l’un des réactifs ci-dessous :
Carbachol : 0,1mM (coté séreux ou basolatéral) Forskoline : 0,1mM (coté séreux ou basolatéral) Glucose : 20mM (coté muqueux ou apical) Histamine : 0,1mM (coté séreux ou basolatéral)
…
Figure1: Tracé type d’un courant de court-circuit. On remarque la variation de l’Isc en fin d’expérience après ajout de la forskoline 10-4M.
(Tracé obtenu avec le logiciel d’acquisition Biomécatronics)
-10
0
10
20
30
40
50
60
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130Isc
(µ
A
/0.
2c
m
²)
Temps (min
) Ch2 Ch3 FSK 10-4M178
5. Hypothèse d’une pompe d’efflux
Etude d’une molécule substrat d’une pompe d’efflux Cas de la P-gp
Protocole :
Une étude de perméation muqueux vers séreux (m > s) et séreux vers muqueux
(s > m) du composé à tester est déterminée comme suit :
Perméation m>s
1 : On place dans le compartiment muqueux une quantité bien déterminée du composé
à tester en solution (échantillon) puis des quantités sont prélevées à intervalle de temps côté séreux puis quantifier.
Soit Q1, la quantité prélevée côté séreux de l’échantillon à tester au temps t.
Perméation s > m
2 : Dans une autre chambre d’Ussing on place dans le compartiment séreux la même quantité du composé à tester en solution puis des quantités bien déterminées sont prélevées côté muqueux puis quantifier.
Soit Q2, la quantité prélevée côté muqueux de l’échantillon à tester au temps t.
►Ajout d’un inhibiteur de la P-gp (Ex : Vérapamil)
3 : On place dans le Compartiment séreux 1mM d’une solution de vérapamil préparée au préalable. Après 10 minutes d’incubation, on ajoute côté séreux la quantité du composé à tester en solution. Des prélèvements sont effectués côté muqueux puis quantifier.
Soit Q3, la quantité au temps t du composé à tester en présence de vérapamil
prélevée côté muqueux.
4 : Dans une autre chambre, On place 1mM de la solution de vérapamil côté séreux.
Après 10min d’incubation, on ajoute côté muqueux la quantité du composé à tester puis des prélèvements sont effectués côté séreux et quantifier.
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Soit Q4, la quantité au temps t du composé à tester obtenu en présence de la
vérapamil côté séreux
Si le composé étudié est substrat de la P-gp, la vérapamil inhibant la P-gp alors Q3
<
Q2 (inhibition de la P-gp par la vérapamil)Q4
>Q1 :
Augmentation de la perméation du composé à tester en solution après inhibition de la P-gp par le vérapamil.
180
Méthodologie du dosage en chambre de perméation d’Ussing : Résumé succincte
Tableau 1. Résumé succinct de la méthodologie expérimentale d’étude de perméabilité en chambre de perméation d’Ussing.
Principe actif ou formulation
Stabilité dans le milieu
Stabilité en condition expérimentale d’Ussing Expérimentation en chambre de perméation d’Ussing Isc (µA/cm2) ddp (mV) Conductance transépithéliale (Gt) ou Résistance transépithéliale (Rt) Flux J
Perméabilité apparente (Papp)
Flux muqueux vers séreux et flux séreux vers muqueux Conditions Si instable Si % de perte très élevé Si Isc ou ddp instable Solutions
. Vérifier les câbles de connexion . Vérifier les électrodes (Nettoyer ou changer si nécessaire) ▪Vérifier le pH, ajuster le pH si pH dépendant
▪Choix d’un autre milieu ou solution ▪Nettoyer les chambres ▪Lubrifier avec du silicone Aquasil ® pour laboratoire ▪Chambres à l’abri de la lumière Recherche d’un inhibiteur approprié Produit stable en condition expérimentale d’Ussing. Le % de pertes éventuelles n’influe pas sur le passage transépithélial Pompe d’efflux c Produit stable en solution ou dans le milieu
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182
Discussion générale
L'administration orale des molécules actives est recherchée en de nombreuses circonstances. Toutefois, la connaissance des mécanismes d'absorption intestinale d'une molécule active est indispensable au développement rationnel de formes pharmaceutiques capables de promouvoir l'absorption la plus complète possible de la molécule et simultanément de conduire au profil plasmatique désiré. Différents modèles expérimentaux permettent d'assurer cette connaissance, allant de modèles mettant en oeuvre des monocouches cellulaires obtenues en culture à des modèles
ex vivo chez l'animal. Dans ce cadre, le présent travail a été consacré au modèle de
la chambre de Ussing. Il avait pour objectif, d'une part d'établir les conditions
expérimentales dans lesquelles il est possible de mesurer les flux d'absorption,
l'impact des conditions expérimentales sur les mesures et, d'autre part, de montrer
l'intérêt du modèle de Ussing lorsque la substance active est associée à une formulation colloïdale, notamment micro émulsions, nanoparticules, etc.
1. Impact des conditions expérimentales sur la grandeur des flux transmembranaires mesurés ainsi que les paramètres électrophysiologiques associés.
Comme cela a été présenté de manière détaillée dans la partie bibliographique de ce document, le modèle de la chambre d’Ussing permet de déterminer, dans une même expérience, les flux d'absorption et/ou de sécrétion d'une molécule d'intérêt tout en déterminant simultanément les courants électriques qui s'établissent de part et d'autre d'un fragment de membrane intestinale maintenu en survie. Plusieurs paramètres sont susceptibles de modifier la perméabilité de la membrane à une molécule d'intérêt, principalement : (i) la nature des milieux de survie placés de part et d'autre de la membrane (compartiment muqueux et compartiment séreux), (ii) l'ajout dans ces milieux de la solution de la molécule d'intérêt pouvant donner lieu à des interactions moléculaires imprévues, (iii) la toxicité éventuelle de ces agents sur la muqueuse elle-même.
Ces phénomènes, selon leur importance, peuvent amener à des résultats peu fiables modifier les flux observés expérimentalement et aboutir ainsi au calcul de valeurs
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Discussion générale
erronées de la perméabilité. Ceci conduit à des interprétations erronées des mécanismes de passage mis en jeu ainsi qu'à des prédictions in vivo erronées.
1.2 Influence de la nature des solutions physiologiques sur le passage transépithélial
Le modèle d’Ussing nécessite l'emploi de solutions aqueuses de survie capables de maintenir intactes les différentes fonctionnalités de la muqueuse pendant la durée de l'expérience (en général 2 ou 3 heures au maximum). Dans une revue très intéressante, Berginc et al (Berginc et al., 2014) ont passé en revue différentes solutions tampons et divers milieux complexes couramment utilisés dans les études in
vitro de perméabilité intestinale en chambre d’Ussing. Il en résulte que la composition des milieux, la nature des sels, les éventuels cosolvants et additifs, ont clairement un impact sur la viabilité et l’intégrité membranaire. De plus, ils sont de nature à modifier les différentes voies de passage (paracellulaire ou transcellulaire) des molécules d'intérêt et aussi selon leur mode de transport (passif/actif).
Ainsi, nous suggérons que les solutions utilisées pour maintenir le fragment de muqueuse fraîchement prélevé en survie doivent également être considérées comme étant des formulations à part entière puisqu'elles peuvent influencer l'état physico-chimique dans lequel se trouve la molécule en modifiant par exemple son état d'ionisation, en modifiant la solubilité, en accélérant la dégradation chimique, en favorisant des interactions avec les sels et/ou d'autres molécules endogènes provenant de la muqueuse. La figure 1 décrit de manière synthétique comment la nature des milieux et des conditions expérimentales est susceptibles d'altérer la physiologie épithéliale et/ou d'induire des modifications physico-chimiques de la molécule d'intérêt.
184
Discussion générale
Figure 1 : Impact potentiel de la nature des solutions physiologiques sur le passage transépithélial déterminé dans le modèle de Ussing
Ainsi, en étudiant la solubilité et la perméabilité de l’ibuprofène à partir de différentes solutions tampons, Levis et al (Levis et al., 2003) ont montré l’effet significatif de leur composition à la fois sur la solubilité et le passage intestinal. Juan et al. (Juan et al., 2010) ont montré que l’incubation du trans-resvératrol dans un milieu tampon Krebs-Henseleit au cours d’une expérience ex vivo dans un modèle d'intestin isolé de rat diminuait de 16% son absorption intestinale après 120 min par rapport au même milieu ne comportant pas de bicarbonate, ce que ces auteurs attribuent au fait que la présence de bicarbonate dans le milieu tampon phosphate de Krebs n'assure pas une stabilité totale du trans-resveratrol.
Dans notre travail, nous avons montré que la nature des ions présents dans les milieux tampons pouvait impacter le passage de certaines molécules. Ainsi, l'acide ascorbique (ou vitamine C) est absorbé pour partie par diffusion simple et également par transport actif sous forme d'ion ascorbate au niveau entérocytaire grâce à deux
185
Discussion générale
cotransporteurs sodium-dépendants, les SVCT1 et SVCT 2 (sodium vitamin C
transporters) (Burzle et al., 2013b; Takanaga et al., 2004; Wilson, 2005). Nos travaux
ont montré que les flux unidirectionnels muqueux vers séreux de la vitamine C déterminés au niveau du jéjunum excisé de rat étaient variables et dépendaient de la composition ionique des solutions employées. Ainsi, lorsqu’on supprime le sodium dans la solution de Ringer (Ringer sans sodium) le flux était diminué de moitié. A l’inverse, dans la solution phosphate de Sörensen, le flux de vitamine C est doublé par rapport à celui obtenu à partir de la solution de Ringer sodium. Cette tendance à l’augmentation a été observée lorsque des dommages aux microvillosités entérocytaires étaient induites par l'ajout de 2% du KCl en excès dans la solution de Ringer.
Dans une étude similaire portant sur l'absorption de la théophylline et de la caféine en solution, il a été montré que le passage jéjunal chez le rat de ces deux molécules mises en solution dans différentes solutions tampon, diminuait en présence de tampon borate et de tampon phosphate. Les auteurs ont attribué cette diminution à une action directe des ions borate sur la muqueuse intestinale, notamment au niveau du mucus (Schurgers et al., 1984). De même, la nature des cations divalents introduits dans les milieux de survie peut influencer les valeurs de flux mesurées. Ainsi, Zakelj et al (Zakelj et al., 2004) ont montré que la viabilité et l’intégrité de la membrane épithéliale montée entre deux demi-chambres de diffusion est compromise lorsque les ions Mg2+
et Ca2+ en solution sont appliqués de manière équivalente de part et d’autre de la membrane. Ce n’est en revanche pas le cas si l’un des deux ions est appliqué unilatéralement d'un des deux côtés de la membrane. Plus classiquement, ces auteurs ont également montré que certains ions tels que le bicarbonate influencent le passage de certaines molécules par modification du pH. A cet effet, nous avons déjà souligné que le maintien du pH de certaines solutions comme la solution de Ringer pouvait poser un problème expérimental, puisque l'oxygénation du milieu par le barbotage au carbogène a tendance à augmenter le pH au cours du temps avec une incidence éventuelle sur la perméabilité épithéliale
186
Discussion générale
Nous avons également évalué l'impact de la nature des solutions de survie sur le passage du paracétamol (acétominophène) et de la vitamine C. Le paracétamol est une substance analgésique très largement utilisée en clinique. Son absorption orale est rapide et s’effectue par un mécanisme de transport passif (Raffa et al., 2014). A ce titre, il constitue donc une substance modèle très pertinente lorsqu'il s'agit de déterminer l’influence des solutions tampons utilisées dans les études de perméabilité
in vitro sur la viabilité, l’intégrité et bien entendu sur la perméabilité. Par ailleurs, la vitamine C est absorbée grâce à un transfert actif sodium dépendant. Elle représente donc un modèle intéressant pour étudier l'impact de la concentration ionique et du sodium en particulier dans les solutions de survies. Dans les deux cas, les flux muqueux vers séreux du paracétamol et de la vitamine C, ainsi que les paramètres électrophysiologiques associés ont été expérimentalement mesurés en présence de différentes solutions de compositions différentes dans l'objectif de mettre en évidence un éventuel rapport entre la perméabilité et la conductance électrique (considérée comme étant un bon index des transports passifs).
Les résultats expérimentaux ont montré que la nature des milieux physiologiques employés pouvait influencer considérablement les flux d'absorption. Dans le cas du paracétamol, un quasi doublement du flux au travers du jéjunum de rat excisé a été observé selon que les milieux utilisés étaient des solutions de Ringer ou de Sorensen. De plus, bien que l'absorption soit rapide dans les deux cas, les flux maximaux de paracétamol sont atteints dès 30 min dans la solution de Sorensen alors que dans la solution de Ringer, il n'est atteint qu'au bout de 1 heure.
L'influence de la nature des milieux est encore plus marquée dans le cas de la vitamine C, pour laquelle les flux muqueux séreux varient d'un facteur 4 !
Une des disparités les plus marquantes est observée lorsqu'on compare le flux de vitamine C obtenu à partir de la solution tampon de Sorensen à celui issu de la solution de Ringer. Ce résultat est d'autant plus surprenant que ces deux solutions comprennent toutes deux du sodium, mais accompagné toutefois de contre-ions différents. Ainsi, dans la solution de Ringer, l’ion sodium est apporté par le chlorure de sodium (NaCl) et le bicarbonate de sodium (NaHC03) alors que dans la solution de
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Discussion générale
tampon de Sorensen, l’ion sodium est apporté à la fois par l’hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4) et le dihydrogénophosphate de sodium (NaH2PO4). De manière parallèle, la conductance de la membrane dépend étroitement des milieux utilisés. Nous avons pu confirmer expérimentalement la complexité des interrelations entre les milieux et la physiologie membranaire en évaluant la fonctionnalité électrophysiologique membranaire par la stimulation des récepteurs par le glucose et le carbachol respectivement dans les solutions de Ringer, de Ringer sans sodium la solution phosphate de Sorensen. Comme la vitamine C, le transport du glucose est sodium dépendant. Toutefois, alors que la vitamine C met en jeu la protéine SVCT1, le glucose est quant à lui transporté au niveau de la lumière intestinale par le cotransporteur Na+ /glucose.
Ainsi, lorsque du glucose (30 mM) est introduit au pôle apical du jéjunum de rat dans les différents milieux étudiés, on observe une forte augmentation du courant de court-circuit (Isc) due à la prise en charge du glucose par le transporteur et l'échange d'ion sodium, confirmé ensuite par l'observation d'une forte réponse au carbachol (10-4 M), un agoniste cholinergique dans la solution de Ringer, alors que dans la Solution de Sorensen cette réponse est 4 fois plus faible et qu'on observe une absence totale de courant de court-circuit (Isc) dans la solution de Ringer sans sodium. La complexité de la composition de la solution de Ringer avec des ions Na+, Cl- et K+, composants cellulaires essentiels, semble donc favoriser l’action du glucose et du carbachol, ce qui n’est pas le cas en solution de Ringer sans sodium et de Sorensen.
Comme le résume la figure 1, une des conséquences pratique de ces travaux est évidemment d'être conscient de l'existence d'interrelations complexes entre les mécanismes cellulaires mis en jeu au cours du transport et la nature des milieux de survie utilisés. Les milieux de survie retenus dans ces études de perméation doivent donc être sélectionnés avec précaution et les résultats quantitatifs considérés comme pouvant être étroitement dépendant des conditions expérimentales mises en oeuvre.
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Discussion générale
1.3 Influence de la nature des solutions physiologiques sur la viabilité de l'épithélium intestinal
Une des préoccupations majeures au cours des études d'absorption intestinale en chambre d’Ussing est de maintenir l'intégrité de la membrane. Outre les facteurs défavorables liés à la composition des solutions de survie, les dommages observés la plupart du temps à la surface muqueuse des tissus intestinaux sont liés au courant de carbogène, susceptible de détacher par effet mécanique la couche protectrice de mucus. Certaines molécules peuvent également avoir un effet toxique qui leur est propre.
Ces effets toxiques peuvent être évalués de différentes manières, plus ou moins indirectes. Tout d'abord, la mesure en continu des paramètres électrophysiologiques de la membrane permet d'évaluer à tout instant son intégrité. Une augmentation du courant de court-circuit (Isc) peut alors traduire un passage facilité des ions au travers