Intérêts et applications de la mesure des paramètres électrique Isc, ddp, Gt ou Rt

G= Isc / ddp (équation 8)

Du point de vue ionique, il est admis que la conductance caractérise la facilité avec laquelle les ions traversent la membrane biologique, notamment via le port aqueux de la protéine canal. Ainsi, (Madara et al., 1985) ont montré dès 1985 que la résistance électrique semblait dépendre de l'intégrité des protéines transmembranaires impliquées dans les jonctions serrées. Ainsi, la variation de la conductance est généralement attribuée à des changements dans la voie paracellulaire et représente un bon indicateur du passage passif des électrolytes au travers de l’épithélium. En conclusion, la ddp et l’Isc sont les deux paramètres électriques qui représentent plus particulièrement le transport transcellulaire, tandis que la variation de la conductance correspond plutôt à des modifications de la voie paracellulaire et à l'établissement de transports d’électrolytes via les jonctions serrées (Griesmard, 1994).

La conductance membranaire (G), ou sa réciproque (R), est une grandeur qui caractérise la perméabilité hydroélectrique du tissu et donc son intégrité physique. A ce titre, il constitue un bon indicateur, déterminable en temps réel, de l’intégrité des tissus et peut aussi être utile pour distinguer le mécanisme d’action et les effets non spécifiques directs des molécules sur les tissus étudiés, par exemple les effets des réactifs utilisés dans les études de passage de molécules d'intérêt (Caraballo et al., 2011; Clarke, 2009).

3.3.3. Intérêts et applications de la mesure des paramètres électrique Isc, ddp, Gt ou Rt

La mesure et la connaissance des paramètres électriques qui prévalent dans les chambres de perméation d’Ussing sont très utiles à la compréhension et l’interprétation des phénomènes physiologiques induits par la mise en contact de certains composés exogènes avec l’épithélium, en termes de perméabilité et de toxicité.

Ainsi, elle permet de mesurer différents paramètres électriques (Isc, ddp) caractéristiques de la membrane étudiée et comme nous l’avons souligné précédemment la détermination de la conductance ou de la résistance membranaire , ce qui apporte des informations d'une part sur l'état physiologique de la membrane

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et d'autre part sur les mécanismes de passages de molécules actives (Moazed et al., 2007) et également l'impact de ces molécules sur l'intégrité membranaire.

En effet, les tissus biologiques tels que l’intestin monté en chambre d’Ussing sont placés directement au contact avec les molécules d’intérêts ajoutées directement dans les chambres. Certaines de ces substances peuvent être préjudiciables à l’intestin, ce qui induit une augmentation de la sécrétion des électrolytes et traduit une diminution de la fonction barrière de l'épithélium (Boudry, 2005).

Ainsi, Navarro - Garcia et al. (Navarro-Garcia et al., 1998) ont mis à profit les chambres d’Ussing pour identifier le rôle d'une protéine toxique produite par Escherichia Coli parmi deux protéines issues de la même souche bactérienne grâce à l'évaluation des paramètres électriques (Isc, ddp et Rt). Leurs travaux ont montré une importante augmentation de ddp et de l’Isc ainsi qu’une diminution de moitié des valeurs de la résistance épithéliale, témoin de l’intégrité tissulaire, en présence de cette protéine. L’étude histologique a permis de constater une nécrose importante avec exfoliation des cellules épithéliales et une forte accumulation de mucus. Ces observations semblent expliquer la diminution de la résistance transépithéliale. Egalement, l’auteur suggère que l’augmentation de l’Isc et la ddp pourrait avoir pour cause la formation de précipité d’ammonium dans le surnageant de culture bactérienne placé dans les chambres d’Ussing.

Awad et al. (Awad et al., 2014) ont montré que le jéjunum de poulet monté en chambre d’Ussing et placé en présence d'une souche aviaire pathogène d’E. coli, subissait une diminution de l’Isc, de ddp et de la conductance (G). Cette diminution de G traduit donc une augmentation de la résistance transépithéliale et suggère à l’auteur un resserrement des jonctions serrées, expliquant probablement l’absence de la diarrhée sécrétoire manifeste observées chez les poulets infectés, cause de la diminution de l’Isc et de ddp.

Rosenthal et al. (Rosenthal et al., 2012) ont étudié l’effet du chitosan sur les mécanismes transcellulaires et paracellulaires en utilisant des monocouches obtenues par coculture des lignées cellulaires colorectales HT-29/B6 en chambre de perméation d’Ussing. Ils ont montré que, la diminution de la résistance transépithéliale (Rt)

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dépendait du pH en raison de l’activation de l'’échangeur d’anion HCOO3^- /Cl-, entraînant une augmentation de la perméabilité paracellulaire du dextran. Ce résultat semble confirmer l’action de certaine molécule dans l’ouverture des jonctions serrées autorisant ainsi le passage paracellulaire passif de certaines molécules (Deli, 2009). Ainsi en utilisant le même modèle de monocouches cellulaires, Dittmann et al.(Dittmann et al., 2014) ont montré une relation entre l’augmentation de la perméabilité à la fluorescéine (marqueur du passage paracellulaire) et la diminution de la résistance transépithéliale. Les auteurs ont pu montrer que l'ajout de laurate de sodium exerçait une action directe sur les jonctions serrées et permettait un passage important de certaines molécules de petite taille.

De même, Brucker et al. (Bucker et al., 2009) sur un modèle similaire, ont montré que l’augmentation de la perméabilité au FITC-dextran était due à la fragilisation de la monocouche épithéliale HT-29 par l'entérobactérie Arcobacter Butzleri. Cette fragilisation entrainant une diminution de la résistance transépithéliale est corrélée à la diminution des protéines des jonctions serrées telles que les claudines et les occludines. En effet, il à été montré que des toxines (Zonula occludens toxin ou "Zot")

produites par certaines bactéries ont une action sur les jonctions serrées (Fasano et al., 1995) entraînant une augmentation du passage paracellulaire de

certaines molécules (Karyekar et al., 2003)

Dans un exemple illustrant bien l'intérêt de ces mesures électriques, Navabi et al. (Navabi et al., 2013) ont cultivé plusieurs lignées intestinales humaines (Caco-2, HT29, T84…) et gastrique (MKN, AGS…) dans des inserts sur support poreux de type Transwell® (voir la figure.9). Le but de leur travail était de sélectionner des lignées cellulaires polarisées, présentant des jonctions serrées fonctionnelles et également capables de produire du mucus. Les auteurs ont utilisé une combinaison des différents paramètres électriques mesurés au moyen de la chambre d’Ussing pour évaluer ces monocouches cellulaires. La résistance transépithéliale a été utilisée pour évaluer la fonctionnalité des jonctions serrées, tandis que la ddp et l’Isc l'ont été pour évaluer l’intégrité fonctionnelle de la membrane, et enfin par la technique consistant à ouvrir les canaux ioniques et mesurer la réponse de l’Isc induite, lorsqu'un stimulus extérieur est utilisé.

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Ces différents exemples montrent l'apport de la mesure des paramètres électriques et leur intérêt non seulement dans l’interprétation des valeurs de la perméabilité transépithéliale mais aussi dans la détermination de possibles effets toxiques de certains composés sur la membrane épithéliale. De plus, d’un point de vue expérimental et pratique, la mesure systématique de la conductance individuellement pour chaque chambre permet de détecter d’éventuels problèmes techniques (chambre mal montée, pont d’agar mal placé, tissu lésé, etc.)

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4. Applications de la chambre d’Ussing à la mesure du passage des