Photo-inhibition des b 4*nAChR dans la voie mHb-IPN

La sous-unité b4 est quasiment absente du CNS mais est fortement exprimée au niveau de la voie habénulo-interpédonculaire (mHb-IPN, Figure 8.3A). Cette voie contient la plus forte densité et diversité de nAChR dans le cerveau324, et les b4*nAChR constituent la majorité des récepteurs nicotiniques exprimés dans l’IPN176. Cette voie, impliquée dans la peur et l’anxiété175, est formée par les neurones glutamatergiques et cholinergiques de la mHb ventrale qui projettent largement sur l’IPN, noyau médial du mésencéphale composé majoritairement de neurones GABAergiques (Figure 8.3B)175.

Figure 8.3 – La voie mHb-IPN et la réponse des neurones de l’IPN à l’injection aiguë de nicotine (i.v.) chez la souris anesthésiée : (A) Représentation sagittale de la voie

VTA-NAc/PFC et de la voie mHb-IPN. Noyau tegmental latérodorsal (LDTg) ; Noyau pédonculo-pontin tegmental (PPTg) ; Aire tegmentale ventrale (VTA) ; Noyau Accumbens (NAc) ; Cortex préfrontal (PFC) ; Habénula médiale (mHb) ; Noyau interpédonculaire (IPN). Les sous-unités nicotiniques exprimées dans la voie mHb-IPN sont indiquées. (B) Représentation schématique des projections de la mHb sur l’IPN. On note que la partie dorsale de la mHb (dmHb) projette préférentiellement vers les bords latéraux de l’IPN, et ces neurones libèrent de la substance P et du glutamate (SP+). Les neurones de la partie ventrale de la mHB (vmHb) projettent

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largement dans l’IPN et co-libèrent de l’ACh et du glutamate. (C) L’utilisation d’un colorant bleu permet la confirmation post hoc du placement de la tétrode dans l’IPN. (D) Exemples de réponses à une injection i.v. aiguë de nicotine montrant soit une augmentation (« activé », gauche) ou une diminution (« inhibé », droite) de la fréquence de décharge de neurones de l’IPN. Haut : raster plot centré sur l’injection de nicotine (rouge). Bas : peri-stimulus event histogram (PSTH) de la fréquence de décharge (bin de 20 s). (E) Réponse moyenne des neurones de l’IPN inhibés (en bleu) et activés (en rouge) par la nicotine (F) Quantification de la réponse moyenne des neurones de l’IPN à l’injection de saline et de nicotine (en bleu les inhibés et en rouge les activés). Données non publiées.

A l’exception d’a9 et a10, toutes les sous-unités nicotiniques sont exprimées dans la voie mHb-IPN324,174. Bien qu’on retrouve une grande diversité de nAChR, la majorité est constituée par les sous-unités a5, a3 et b4324,325. Ces trois sous-unités sont codées par un cluster de gènes (CHRNA5-A3-B4) du locus humain 15q25 et des études récentes de génétique humaine ont montré une association entre ce locus, la dépendance à la nicotine et la prévalence du cancer du poumon326,327. Des études récentes ont montré le rôle des nAChR de l’IPN dans l’addiction à la nicotine à la fois dans l’aversion pour la substance179, l’apparition des symptômes de manque177,328,329 mais aussi dans la régulation de la consommation172. De plus, au cours de ma thèse j’ai participé à une étude montrant que a5 au niveau de l’IPN joue un rôle clé dans les mécanismes de rechute (Forget & al, 2018, voir Annexes 2).

Chez l’animal anesthésié, nous observons dans l’IPN (Figure 8.3C), comme dans la VTA, une hétérogénéité de réponses à l’injection systémique aiguë de nicotine (30 µg/kg, i.v.) avec une population de neurones activés et une population de neurones inhibés (Figure 8.3D-F). Afin de mieux comprendre le rôle de la sous-unité b4 à la fois dans la modulation cholinergique endogène des neurones de l’IPN et dans les différentes étapes de l’addiction à la nicotine, nous déployons actuellement la technique de pharmacologie optogénétique pour cette sous-unité. Nous nous reposons sur les travaux antérieurs de l’équipe de Richard H. Kramer qui avait développé un b4*LinAChR analogue au b2*LinAChR5.

Suite à l’injection d’un lentivirus permettant d’exprimer la sous-unité b4E61C dans l’IPN chez des souris wt (Figure 8.4A-B), nous observons ex vivo une diminution de l’amplitude des courants évoqués par l’application locale de nicotine (30 µM) sous la lumière violette, lorsque les b4E61C*LinAChR sont photo-inhibés (Figure 8.4C). Les enregistrements préliminaires effectués in vivo, montrent que la photo-inhibition de ces récepteurs nous permet de réduire l’amplitude de la réponse évoquée par l’injection intraveineuse de nicotine (Figure 8.4D-E).

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Figure 8.4 – Photo-inhibition des b4*LinAChR ex vivo et in vivo : (A) Construction utilisée

pour la transfection des neurones de l’IPN avec le mutant cystéine. (B) Immunohistochimie de la GFP montrant une infection circonscrite à l’IPN. (C) L’amplitude des courants évoqués par

l’application locale de nicotine (puff de 200ms, nicotine 30 µM, n=5) est significativement

réduite sous la lumière violette (380 nm) et est complètement restaurée sous la lumière verte (525 nm). (D) Exemple de neurone enregistré in vivo chez une souris anesthésiée : la réponse

évoquée par l’injection aiguë de nicotine (30 µg/kg, i.v.) est abolie sous lumière violette et

partiellement restaurée sous lumière verte. (E) Représentation de la réponse moyenne des neurones de l’IPN sous lumière violette et sous lumière verte (gauche). L’amplitude moyenne de la réponse semble diminuée sous lumière violette et est restaurée sous lumière verte. Données non publiées.

Nous nous sommes aussi intéressés à l’impact de la modulation cholinergique endogène sur l’activité des neurones de l’IPN. Dans ce but, nous avons utilisé le même dispositif expérimental que celui décrit précédemment pour les enregistrements de neurones DA de la VTA. L’infection lentivirale dans l’IPN nous permet de restreindre l’expression du mutant cystéine aux neurones de l’IPN (Figure 8.5A). Alors que le MAHoCh seul ne semble pas avoir d’effet sur le firing des neurones de l’IPN (Figure 8.5B-C), nous observons après transfection que deux tiers des neurones présentent une modulation de leur firing lors de l’alternance de

flashs de lumière violette et verte (5s/5s, Figure 8.5B). De plus, nous observons que cette

modulation est bidirectionnelle avec une population de neurones inhibés lors de la photo-inhibition des b4*LinAChR (Type I) et une population de neurones activés (Type II, Figure

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8.5D-E). Ces résultats préliminaires suggèrent que l’ACh libérée par les neurones de la mHb module l’activité des neurones de l’IPN en agissant sur les b4*nAChR post-synaptiques. Ils sont en accord avec des expériences d’électrophysiologie en tranche récentes, qui montrent que l’activation optogénétique des neurones ChAT+ de la mHb évoque la libération de glutamate et d’ACh, et induit des courants post-synaptiques dans les neurones de l’IPN173,330.

Figure 8.5 – Photo-modulation de la transmission nicotinique endogène in vivo dans l’IPN :

(A) L’infection lentivirale dans l’IPN permet de restreindre l’expression du mutant cystéine au niveau somatique dans les neurones de l’IPN en laissant les terminaisons de la mHb intactes. (B) Distribution cumulative représentant la proportion des neurones enregistrés en fonction de

leur pourcentage absolu de photoswitching (photoswitching = (Freq520 – Freq390) / Freq520)).

Noir : neurones en condition contrôle. Gris : neurones enregistrés chez les individus transduits

avec la construction β4E61C. (C) Fréquence de décharge spontanée sous lumière violette (390

nm) et lumière verte (520 nm) des neurones de l’IPN en condition contrôle (MAHoCh seul). (D) Exemples d’enregistrements en tétrodes pour un neurone de type I (haut) et un neurone de type II (bas). (E) Fréquence de décharge spontanée sous lumière violette (390 nm) et lumière verte (520 nm) des neurones type I et II de l’IPN chez les individus transduits avec la

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