Phosphorylation de l’α-syn par les PLKs

Des travaux récents ont rapporté qu’en plus de leur rôle dans la régulation du cycle cellulaire, certaines PLKs sont capables de phosphoryler les synucléines. Cette phosphorylation s’avère spécifique puisque PLK2 et PLK3 peuvent phosphoryler l’α- syn au site Sérine 129, tandis que la β-syn est phosphorylée sous l’action de PLK1 et -3 au résidu Sérine 118108. Le fait que des membres différents des PLKs phosphorylent une synucléine en particulier reflète leur spécificité au substrat et suggère que cette interaction exige une complémentarité entre la kinase et son domaine spécifique sur les synucléines. Une deuxième caractéristique de la phosphorylation des synucléines par les PLKs est leur efficacité. En comparaison avec les autres kinases capables d’agir sur les synucléines, la PLK1, -2 et -3 sont considérées comme les kinases avec le plus haut rendement à phosphoryler l’α-syn108.

Contrairement à l’α-syn, les autres membres de la famille des synucléines, la β– syn et la γ–syn, ne se trouvent pas dans les CLs230, formes pathologiques des synucléinopathies. Par conséquent, nous décrirons dans les prochains paragraphes l’action des PLKs exclusivement sur l’α-syn.

Dans le cas de l’α-syn, lesPLK2 et -3 sont considérées comme les 2 kinases les plus efficaces induisant un rapport α-syn phosphorylée sur α-syn totale élevé. Ces statistiques sont issus des études qui se basent sur la surexpression de l’α-syn dans des cultures cellulaires avec ses éventuelles kinases les GRKs108,194. Ces résultats ont été confirmés in vivo par les travaux de Inglis et ses collègues qui déclarent la PLK2 comme le majeur inducteur de la phosphorylation de l’α-syn et sa délétion provoque la baisse d’environ 70% du niveau de l'α-syn pS129185. Dans d’autres études, la délétion à la fois de la PLK2 et -3, dans des cultures de cellules mammaliennes et des neurones primaires, résulte à une réduction significative des niveaux de l’α-syn pS129108.

De plus, il a été démontré dans des cellules mammaliennes, des cultures primaires de neurones hippocampiques et des coupes histologiques des zones corticales des

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cerveaux transgéniques surexprimant l’α-syn, une co-localisation de la PLK2 et -3 dans les différents compartiments cellulaires avec l’α-syn pS129108,181. Par ailleurs, il a été montré que l’expression de la PLK2 dans des neurones hippocampiques ou corticaux extraits des patients atteints de la maladie d’Alzheimer ou de la démence à corps de Lewy est augmentée par rapport à son niveau dans les cerveaux contrôles231.

La différence entre l’efficacité des PLKs à phosphoryler l’α-syn est due aux variations de leurs séquences protéiques. Sur le plan structural, la PLK4, exceptionnellement, ne présente qu’un seul domaine PBD rappelant son importance dans l’interaction avec les substrats. Or, la PLK2 et -3 sont les 2 membres de cette famille avec le plus haut pourcentage d’homologie (68 et 97% d’homologie entre PLK2 et -3 du domaine catalytique et de site d’insertion de l’ATP, respectivement)232. Ces deux dernières, la PLK2 et -3,présentent environ 53 et 86-90% d’homologie respectivement avec la PLK1232.

Ces kinases, comparées aux autres kinases agissant sur l’α-syn, sont les plus efficaces à induire la phosphorylation d’α-syn au S129 in vitro et in vivo. En effet, cette efficacité valorise leur importance dans l’étude du processus de la phosphorylation d’α- syn au S129 et sa toxicité. Aussi, elles peuvent être exploitées dans le développement d’un moyen thérapeutique éventuel contre la MP et les autres synucléinopathies soit en modulant leur activité ou en contrôlant leurs interactions avec leurs substrats spécifiques.

1.3.4. Effet de la phosphorylation sous l’action de la PLK2 sur l’expression, l’agrégation et la toxicité de l’α-syn : Un survol sur les résultats précédents du laboratoire

Dans les cerveaux âgés233, ceux atteints par des synucléinopathies121,181,186, particulièrement la pathologie du Parkinson, et les modèles animaux transgéniques de la MP234–237, l’α-syn pS129 s’accumule. Notre laboratoire s’est concentré sur l’étude du rôle de cette phosphorylation dans la physiologie de l’α-syn et sa toxicité dans des

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cultures cellulaires et chez des rats transgéniques, développant les caractéristiques de la pathologie grâce à une surexpression de l’α-syn avec sa kinase la plus efficace (la PLK2). L’efficacité de la PLK2 à phosphoryler l’α-syn spécifiquement au niveau du site S129 a été démontré suite à de nombreux tests in vitro238, dans des cultures cellulaires108 et in vivo185. Ceci a été confirmé dans une étude récente publiée en 2013194 par notre laboratoire (Figure 10 A et C) qui a caractérisé l’interaction de l’α-syn avec la PLK2, sa phosphorylation et son effet dans la pathologie de Parkinson, in vitro et in vivo.

Les résultats de cette étude démontrent que l’α-syn et la PLK2, surexprimées dans les neurones dopaminergiques, interagissent d’une manière ATP-dépendante exigeant le site de phosphorylation Sérine 129 sur l’α-syn et la région liant l’ATP sur la PLK2, suggérant que la phosphorylation et la fixation de l’ATP induisent des modifications structurales assurant l’interaction entre les 2 protéines198,232. Suite à la formation de ce complexe, ce dernier est dirigé vers la voie de dégradation autophagique (Figure 10 B), contrairement à ce qui a été suggéré dans des études antérieures rapportant que l’α-syn pS129 est la cible de la voie protéasomique239,240. Cet effet est contrôlé par l’activité kinase de la PLK2 et la phosphorylation de l’α-syn particulièrement au site S129, étant donné qu’une surexpression de la PLK2 KDM (une PLK2 mutée inactive) ou l’α-syn S129A (le résidu sérine 129 est remplacé par une alanine) supprime l’effet de la PLK2. De plus, cette action est spécifique à la PLK2, car seulement la PLK2, et non pas d’autres kinases (GRKs), est capable de réduire le niveau d’α-syn dans un modèle de culture cellulaire (Figure 10 C). Cette spécificité peut être expliquée par l’efficacité de la PLK2 à phosphoryler l’α-syn (Figure 10 C). L’élimination de son substrat grâce à son activité phosphorylante s’avère une caractéristique marquante de la fonction physiologique de la PLK2.

Figure 11: La surexpression spécifique autophagique in vitro194_{. (A) Résultat}

d’expression de l’α-syn en présence des quantités élevées de ont été co-transfectées avec 1µg d’

d’éliminer la possibilité d’une perte d’épitopes) et avec des concentrations élevées de PLK2 (0.5,1 et 2µg). La quantité totale d’ADN fut

montrent que la PLK2 réduit le niveau d

0.01). (B) Résultats du Western blot et quantification du niveau de HEK co-transfectées avec 0.5µg PLK2 et 1µg

protéasomique (50 nM epoxomicine et 10µM MG132) ou des inhibiteurs de l’autophagie (10 mM 3MA et 25mM NH4Cl). Ces résultats

une inhibition de l’autophagie

illustrant les niveaux de l’α-syn et de la (1µg) avec 0.5µg soit de la PLK2 ou

seulement l’activité de la PLK2 induit la dégradation de l’ efficacité dans la phosphorylation de l’

0.01).

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La surexpression spécifique de la PLK2 favorise l’élimination de l’α

(A) Résultats du Western blot et quantification des niveaux syn en présence des quantités élevées de la PLK2. Des cellules HEK293T nsfectées avec 1µg d’α-syn (différents plasmides soit en BD, 211 ou FL140 afin d’éliminer la possibilité d’une perte d’épitopes) et avec des concentrations élevées de PLK2

µg). La quantité totale d’ADN fut égalisée par ajout de pCDNA-empty. Les ue la PLK2 réduit le niveau d’α-syn d’une manière concentration dépendante Résultats du Western blot et quantification du niveau de l’α-syn dans des

transfectées avec 0.5µg PLK2 et 1µg α-syn et traitées avec des inhibiteurs de la voie epoxomicine et 10µM MG132) ou des inhibiteurs de l’autophagie (10 Cl). Ces résultats montrent une suppression de l’effet de la PLK2 sous une inhibition de l’autophagie (**P < 0.01). (C) Résultats du Western blot et des histogrammes

syn et de la pS129, dans des cellules HEK surexprimant l’α PLK2 ou les GRKs (GRK-3,-5 ou -6). Ces résultats montrent que seulement l’activité de la PLK2 induit la dégradation de l’α-syn par autophagie, grâce à son efficacité dans la phosphorylation de l’α-syn au S129, en comparaison avec les GRKs

e l’α-syn par voie du Western blot et quantification des niveaux PLK2. Des cellules HEK293T BD, 211 ou FL140 afin d’éliminer la possibilité d’une perte d’épitopes) et avec des concentrations élevées de PLK2 empty. Les résultats syn d’une manière concentration dépendante (**P < dans des cellules syn et traitées avec des inhibiteurs de la voie epoxomicine et 10µM MG132) ou des inhibiteurs de l’autophagie (10 ’effet de la PLK2 sous (C) Résultats du Western blot et des histogrammes xprimant l’α-syn 6). Ces résultats montrent que syn par autophagie, grâce à son syn au S129, en comparaison avec les GRKs (**P <

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Les résultats issus de cette étude démontrent que la surexpression de l’α-syn et de la PLK2 dans des cultures cellulaires ou des cerveaux de rats (grâce au virus adéno- associé, AAV pour adeno associated virus en anglais) induit une accumulation de l’α- syn pS129 qui est associée à une réduction du niveau de l’α-syn totale, la diminution de la perte des neurones dopaminergiques et la suppression des symptômes du parkinsonisme observés chez les rats transgéniques (Figure 10 et 11).

Figure 12: La PLK2 wt induit la baisse du niveau d’α-syn et supprime sa toxicité, in vivo194_.

(A) Des images en microscopie confocale démontrent une co-localisation de l’α-syn et de la PLK2 dans les neurones DAergiques co-infectés (Scale bar: 5 µm) (B) Des images en microscopie confocale (Scale bar: 5 µm)et un histogramme détectent le niveau neuronal de l’α- syn par neurone(**P < 0.01). D’après ces résultats, on montre une réduction de la quantité de l’α-syn seulement en présence de la PLK2 wt et non pas KDM. L’activité kinase de la PLK2 est essentielle pour l’élimination de l’α-syn, in vivo. (C) Photomicrographies et histogramme illustrant les quantifications stéréologiques des neurones DAergiques dans la région injectée (la SNpc) montrant qu’une surexpression de l’α-syn seule ou avec la PLK2 KDM résulte dans une perte significative des neurones DAergiques. En présence de la PLK2 wt, la toxicité neuronale est supprimée (**P < 0.01).

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En conclusion, ces travaux ont démontré que la phosphorylation de l’α-syn au S129 tend à prémunir la maladie contrairement à ce qui a été déclaré auparavant. Un acteur principal de cet effet est la PLK2 qui grâce à son rôle régulateur de l’évacuation de l’α-syn par voie autophagique, réussit à réduire la toxicité neuronale et à assurer une certaine neuroprotection. Cet effet neuroprotecteur de la pS129 a été décrit, entre autre, par Chen et Feany190 qui ont démontré que la suppression de la pS129 augmente l’agrégation de l’α-syn. Il a aussi été confirmé par une autre équipe que l’α-syn pS129 est soluble et ne peut pas être la cause de l’agrégation de l’α-syn240. Cependant cette voie d’élimination d’α-syn sous l’action de la PLK2 est méconnue. À cet égard, l’objectif de mon projet de maîtrise consiste à décortiquer cette voie de dégradation ainsi qu’identifier les différents acteurs moléculaires impliqués.

Ces résultats ont orienté les travaux de recherche vers la régulation du niveau de la PLK2 ou de son activation pour le développement d’une stratégie thérapeutique viable pour le traitement de la MP et d’autres synucléinopathies.

Figure 13: Schéma résumant le mécanisme d’élimination de l’α-syn par voie autophagique, sous l’action kinase de la PLK2194_{. La PLK2 interagit avec l’α-syn et la phosphoryle au résidu}

S129, ainsi l’α-syn va être évacuée vers la voie autophagique. La baisse du niveau de l’α-syn assure une neuroprotection.

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