-L’activation de la voie de dégradation de l’α-syn catalysée par la PLK2, comme stratégie thérapeutique pour la MP
Vers la recherche d’une stratégie thérapeutique viable pour la MP, notre équipe a choisi de se concentrer sur l’étude des causes de toxicité de l’α-syn et les différents paramètres régulant son accumulation et son agrégation, ainsi que l’identification des stratégies menant à réduire cette accumulation et de contrecarrer sa nocivité in vivo. Dans cette perspective, au cours de ma maîtrise, je me suis intéressée à l’étude de la voie de dégradation de l’α-syn catalysée par la PLK2 nouvellement décrite par notre laboratoire. En effet, mon but principal était de décortiquer les différentes étapes de ce parcours qui s’avère un moyen spécifique et efficace contre la pathogénicité de l’α-syn.
Les résultats que j’ai obtenus durant ma maîtrise tendent à diriger les études futures vers de nouvelles pistes thérapeutiques. En effet, cette étude met en évidence le rôle clé de la PLK2 dans l’élimination de l’α-syn. Ainsi, la régulation de l’activité de cette kinase semble être un moyen efficace et spécifique de régulation du niveau de l’α-syn et donc de prévenir la progression de la MP. Dans le but de la recherche d’un moyen thérapeutique visant l’action de la PLK2 sur l’α-syn, un criblage à haut débit pourrait être réalisé (de l’Anglais : the screening strategy). Cette technique permettrait alors d’identifier de manière sensible et très spécifique, parmi des centaines de milliers de molécules existantes, des candidats pharmacologiques capables de stabiliser la PLK2 et augmenter son activité. Dans ce cadre, des études récentes ont démontré que le domaine polo-box régule la stabilité de la PLK2257 et que l’inhibition pharmacologique de ce domaine pourrait induire l’accumulation de cette protéine. Afin de vérifier cette hypothèse, j’ai testé l’effet de certains inhibiteurs spécifiques au domaine polo-box de la PLK2, tels que la thymoquinone (TQ) et son dérivé synthétique la poloxine258,259, sur l’expression et la stabilité de la PLK2 ainsi que l’accumulation de l’α-syn, dans des cultures cellulaires. Des expériences où j’ai traité des cellules HEK 293T qui surexpriment l’α-syn et la PLK2 avec des concentrations croissantes de la TQ (10 et
20µM) ont été faites. Les résultats obtenus
du niveau d’α-syn d’une manière concentration observations préliminaires montrent que
box de la PLK2 est suffisante pour activer la voie de dégradation de l’ par la PLK2 et ainsi favoriser plus l’action de la PLK2.
Les prochaines étapes c et plus sélectifs du domaine polo
chimiques. Par la suite, l’effet des candidats pharmacologiques identif dégradation de l’α-syn sera étudié en culture cellulaire e
transgénique de la MP chez la souris.
Figure 15: La TQ favorise l’action de la PLK2 sur l’α détectant le niveau d’expression de l’
cellules furent transfectées par 1µg
cellules étaient traitées à 10 ou 20 µM de la TQ pendant 7h. dans du laemmli 1X. (B)Histogramme rep
l’actine. Cette quantification montre que, sous traitement à la TQ, la baisse du niveau de l’ 77
ont été faites. Les résultats obtenus montrent que le traitement induit une d’une manière concentration-dépendante (Figure 15 observations préliminaires montrent que l’inhibition pharmacologique du domaine box de la PLK2 est suffisante pour activer la voie de dégradation de l’α-syn par la PLK2 et ainsi favoriser plus l’action de la PLK2.
Les prochaines étapes consistent à identifier des inhibiteurs avec plus
us sélectifs du domaine polo-box de la PLK2 à partir d’une banque de composés chimiques. Par la suite, l’effet des candidats pharmacologiques identif
sera étudié en culture cellulaire et in vivo dans un modèle chez la souris.
La TQ favorise l’action de la PLK2 sur l’α-syn. (A) Résultat du Western blot détectant le niveau d’expression de l’α-syn et de la PLK2 dans des cellules HEK 293T. Ces ent transfectées par 1µg α-syn et 0.5µg DDK-PLK2. 24h post-transfection, les cellules étaient traitées à 10 ou 20 µM de la TQ pendant 7h. La fraction protéique fu
dans du laemmli 1X. (B)Histogramme représentant le niveau d’α-syn normalisé par rapport à l’actine. Cette quantification montre que, sous traitement à la TQ, la baisse du niveau de l’
montrent que le traitement induit une baisse (Figure 15). Ces l’inhibition pharmacologique du domaine polo-
syn catalysée
plus de potentiel partir d’une banque de composés chimiques. Par la suite, l’effet des candidats pharmacologiques identifiés sur la dans un modèle
Résultat du Western blot ules HEK 293T. Ces transfection, les La fraction protéique fut extraite syn normalisé par rapport à l’actine. Cette quantification montre que, sous traitement à la TQ, la baisse du niveau de l’α-syn
78
est plus favorisée d’une manière concentration-dépendante. On conclue que la TQ favorise l’action de la PLK2 et augmente la dégradation de l’α-syn.
-L’élimination des formes agrégées de l’α-syn pourrait représenter une autre stratégie thérapeutique de la MP
Mon étude in vitro sur la caractérisation de la voie de dégradation de l’α-syn via PLK2 ouvre la voie à certaines expériences complémentaires qu’il sera pertinent de réaliser. Vu que dans mes travaux décrits ci-haut l’action de la PLK2 a été observée uniquement sur la protéine α-syn monomérique, il sera intéressant de vérifier si cette kinase est aussi capable d’exercer le même effet sur l’élimination des formes agrégées. Dans certaines conditions pathologiques, l’α-syn s’accumule et se rassemble dans des agrégats. Ces agrégats sont reconnus pour leur toxicité et leur capacité à provoquer la neurodégénérescence8,138,160,161, d’où le fort potentiel thérapeutique pour la MP advenant une démonstration que PLK2 est capable d'induire l'élimination de ces agrégats.
Ceci est rendu possible avec l’existence d’un modèle cellulaire basé sur l’inoculation des formes fibrillaires préformées d’α-syn qui induisent des inclusions ressemblantes aux corps de Lewy260. Dans ce modèle nous proposons de surexprimer la PLK2 et d’étudier son effet sur la stabilité des agrégats d’α-syn et sur leur toxicité (par exemple le test lactate déshydrogénase (LDH), le test MTT (une méthode rapide de numération des cellules vivantes),...).
Il existe aussi un modèle in vivo basé sur l’injection intracérébrale des formes fibrillaires préformées de l’α-syn qui sont capables d’induire la formation des inclusions pathologiques dans le cerveau de souris261. Dans ce modèle, il serait intéressant d’induire l’expression de la PLK2 directement dans le cerveau, en utilisant des particules virales adeno-associées, et de vérifier l’effet de cette surexpression sur le niveau de mort cellulaire (toxicité neuronale) et par des mesures comportementales (les symptômes parkinsoniens développés suite à la présence des agrégats de l’α-syn).
79
Ces expériences vont aider d’une part, à tester si la PLK2 serait capable d’éliminer les formes agrégées ainsi que les formes monomériques de l’α-syn et, d’autre part, à identifier l’élimination des formes agrégées de l’α-syn par la PLK2 comme nouvelle cible thérapeutique de la MP.
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