Cytoplasme Nucléoplasme Nucléole
Ilf3-C WT - ++ - ∆RGG - ++ -/+ R609A - ++ - R609F - ++ - R609K - ++ - R609L - + +
Tableau 7 : Tableau récapitulatif des localisations subcellulaires observées pour les protéines Ilf3, formes courtes (C), sauvages (WT), délétées (∆RGG) ou mutées au niveau de l’arginine (R609A, R609F, R609K et R609L), étiquetées avec la GFP.
-‐ : aucune signal ; -‐/+ : très faible signal ; + : signal faible ; ++ : signal fort.
L’étude de la localisation des protéines Ilf3 et NF90 sauvages ou mutées, surexprimées dans les cellules HeLa a permis de constater que, dans le plan focal observé, aucune de ces protéines n’est localisée dans le cytoplasme. En effet, le ratio noyau/cytoplasme reste inchangé. Cela permet d’en déduire que ni l’arginine 609, ni le motif RGG contenant l’arginine diméthylable, et donc probablement sa diméthylation ne jouent un rôle dans leur localisation nucléocytoplasmique.
2-‐ Phosphorylation de la sérine 190/203
Dans la littérature, aucune fonction biologique n’a été associée avec la phosphorylation de la sérine 190/203 même pas une quelconque implication dans sa localisation subcellulaire. En revanche, Pei et ses collaborateurs ont montré que, dans des cellules Jurkat, une lignée de lymphocytes T humains, la phosphorylation de la sérine 647 lors d’une réaction catalysée par AKT entraîne l’export nucléaire de NF90 (Pei et al., 2008). Il a donc été vérifié si la modification post-‐traductionnelle de la sérine 190/203 pourrait être impliquée dans un processus similaire. Pour cela, deux mutants ont été construits. En effet, la sérine a été substituée par un acide aminé non polaire, l’alanine, et un acide aminé mimant la phosphorylation, l’aspartate. Comme pour la diméthylation, les plasmides ont été transfectés dans les cellules HeLa et après 48 heures, ces dernières ont été incubées avec les anticorps DM1A et anti-‐B23.
Les localisations des protéines Ilf3-‐C sauvages (WT) et mutées (S190A ou S190D) (Figure 45 et Figure 46, panneau A ; Tableau 8) ne diffèrent pas. En effet, aucune de ces différentes formes n’est retrouvée dans le cytoplasme, comme cela est montré par l’absence de co-‐localisation avec l’α-‐tubuline (Figure 45, panneau A). Toutes ces protéines sont nucléaires, voire faiblement nucléolaires comme il est possible de le constater par comparaison avec la localisation de B23 (Figure 46, panneau A).
Pour Ilf3-‐L WT et ses mutants, les images ne montrent pas de différence de localisation (Figure 45 et Figure 46, panneau B ; Tableau 8). Les protéines recombinantes sont nucléolaires (Figure 46, panneau B) comme attendu.
Les images obtenues pour NF90-‐C WT et S190D sont à nouveau identiques (Figure 47 et Figure 48, panneau A ; Tableau 8) avec une localisation très nucléoplasmique, voire quelque peu nucléolaire. Toutefois, les protéines NF90-‐C S190A semblent être nucléolaires (Figure 48, panneau A). Comme pour la diméthylation et les protéines Ilf3-‐ C, ce résultat est surprenant puisque ces isoformes ne contiennent pas la séquence de localisation nucléolaire à leur extrémité N-‐terminale. Cette localisation pourrait s’expliquer par la surexpression des protéines. En effet, il a été vu dans la partie I (page 89) que la quantité de protéine recombinante transfectée accroît d’un facteur 100 à 200 et que de la mort cellulaire commence à apparaître au bout de 24 à 48 heures. Les perturbations entraînées par ce très fort accroissement pourraient donc être à l’origine de la localisation nucléolaire des protéines observée.
Pour finir, les protéines NF90-‐L mutées présentent les mêmes caractéristiques de localisation subcellulaire (Figure 47 et Figure 48, panneau B ; Tableau 8) entre elles puisque les isoformes S190A et S190D sont localisées dans le nucléoplasme et le nucléole. La protéine NF90-‐L sauvage, quant à elle, semble uniquement nucléolaire (Figure 47, panneau B), ce qui correspond aux résultats attendus pour des formes longues. Cette localisation nucléoplasmique pour les formes mutées pourrait être due à la surexpression de la protéine dans les cellules. En effet, la protéine recombinante étant fortement exprimée et le nucléole n’étant pas très volumineux, ce dernier est surchargé en protéines, « débordant » ainsi dans le nucléoplasme.
Les protéines Ilf3 et NF90 mutées, isoformes courtes ou longues, se localisent de manière similaire avec les formes sauvages. Elles restent nucléaires et ne sont donc pas
exportées au cytoplasme. Par conséquent, la phosphorylation de la sérine 190/203 ne semble pas impliquée dans le processus de transport nucléocytoplasmique de ces protéines.
A
Ilf3-C
DM1A GFP DAPI Merge
WT
S190A
S190D
B
Ilf3-L
DM1A GFP DAPI Merge
WT
S203A
S203D
Figure 45 : Distribution subcellulaire des protéines Ilf3 (formes courtes (C) ou longues (L)) sauvages (WT) ou mutées au niveau de la sérine (S190A et S190D) fusionnées à la GFP. (A) Plasmide pEF1/V5-‐His B Ilf3-‐C WT, S190A et S190D, (B) Plasmide pEF1/V5-‐His B Ilf3-‐L WT, S190A et S190D. Quarante-‐huit heures après la transfection des plasmides dans des cellules HeLa, celles-‐ci sont traitées avec l’anticorps anti-‐DM1A et le DAPI. Sur les plans focaux observés dans cette figure, les protéines fusionnées à la GFP apparaissent en vert, la tubuline (DM1A) en rouge et le DAPI en bleu.
A
Ilf3-C
B23 GFP DAPI Merge
WT
S190A
S190D
B
Ilf3-L
B23 GFP DAPI Merge
WT
S203A
S203D
Figure 46 : Distribution subcellulaire des protéines Ilf3 (formes courtes (C) ou longues (L)) sauvages (WT) ou mutées au niveau de la sérine (S190A et S190D) fusionnées à la GFP. (A) Plasmide pEF1/V5-‐His B Ilf3-‐C WT, S190A et S190D, (B) Plasmide pEF1/V5-‐His B Ilf3-‐L WT, S190A et S190D. Quarante-‐huit heures après la transfection des plasmides dans des cellules HeLa, celles-‐ci sont traitées avec l’anticorps anti-‐B23 et le DAPI. Sur les plans focaux observés dans cette figure, les protéines fusionnées à la GFP apparaissent en vert, les protéines B23 en rouge et le DAPI en bleu.
A
NF90-C
DM1A GFP DAPI Merge
WT
S190A
S190D
B
NF90-L
DM1A GFP DAPI Merge
WT
S203A
S203D
Figure 47 : Distribution subcellulaire des protéines NF90 (formes courtes (C) ou longues (L)) sauvages (WT) ou mutées au niveau de la sérine (S190A et S190D) fusionnées à la GFP. (A) Plasmide pEF1/V5-‐His B NF90-‐C WT, S190A et S190D, (B) Plasmide pEF1/V5-‐ His B NF90-‐L WT, S190A et S190D. Quarante-‐huit heures après la transfection des plasmides dans des cellules HeLa, celles-‐ci sont traitées avec l’anticorps anti-‐DM1A et le DAPI. Sur les plans focaux observés dans cette figure, les protéines fusionnées à la GFP apparaissent en vert, la tubuline (DM1A) en rouge et le DAPI en bleu.
A
NF90-C
B23 GFP DAPI Merge
WT
S190A
S190D
B
NF90-L
B23 GFP DAPI Merge
WT
S203A
S203D
Figure 48 : Distribution subcellulaire des protéines NF90 (formes courtes (C) ou longues (L)) sauvages (WT) ou mutées au niveau de la sérine (S190A et S190D) fusionnées à la GFP. (A) Plasmide pEF1/V5-‐His B NF90-‐C WT, S190A et S190D, (B) Plasmide pEF1/V5-‐ His B NF90-‐L WT, S190A et S190D. Quarante-‐huit heures après la transfection des plasmides dans des cellules HeLa, celles-‐ci sont traitées avec l’anticorps anti-‐B23 et le DAPI. Sur les plans focaux observés dans cette figure, les protéines fusionnées à la GFP apparaissent en vert, les protéines B23 en rouge et le DAPI en bleu.
Cytoplasme Nucléoplasme Nucléole Ilf3-C WT - + ++ S190A - ++ -/+ S190D - + - Ilf3-L WT - -/+ ++ S203A - -/+ ++ S203D - + + NF90-C WT - + -/+ S190A - -/+ ++ S190D - ++ ++ NF90-L WT - -/+ ++ S203A - ++ ++ S203D - ++ ++
Tableau 8 : Tableau récapitulatif des localisations subcellulaires observées pour les protéines Ilf3 et NF90, formes courtes (C) ou longues (L), sauvages (WT) ou mutées au niveau de la sérine (S190/203A, S190/203D), étiquetées avec la GFP.
-‐ : aucune signal ; -‐/+ : très faible signal ; + : signal faible ; ++ : signal fort.
Suite à cette étude, il a été conclu que la diméthylation de l’arginine 609/623 ainsi que la phosphorylation de la sérine 190/203 ne semblent pas être directement impliquées dans la localisation subcellulaire des protéines Ilf3 et NF90.
Une autre fonction potentielle des modifications post-‐traductionnelles est de réguler les interactions entre une protéine et ses partenaires.
Ainsi, la seconde partie de mon travail de thèse a été consacrée à l’étude par GST pull-‐ down du potentiel rôle des deux modifications post-‐traductionnelles précédemment caractérisées dans la régulation de l’interaction des protéines Ilf3 et NF90 avec leurs partenaires protéiques.
III. Interactions protéines -‐ protéines : rôles des
modifications post-‐traductionnelles