Il semble que les protéines Ilf3 et NF90 fassent la navette entre le noyau et le cytoplasme pour participer à diverses fonctions cellulaires. Cependant, les évènements moléculaires qui régulent cette distribution intracellulaire ne sont pas encore totalement élucidés.
L’étude de la localisation subcellulaire des protéines Ilf3 et NF90 sauvages ou mutées a été réalisée par transfection dans des cellules HeLa de plasmides permettant leur expression en phase avec la GFP suivie d’observation par microscopie confocale. Pour cela, les vecteurs d’expression (pEF1/V5-‐His B) ont été transfectés dans les cellules HeLa puis 48 heures après, les cellules ont été traitées avec :
-‐ un anticorps dirigé contre l’α-‐tubuline, une protéine spécifique des microtubules qui permet de visualiser le cytoplasme,
-‐ un anticorps dirigé contre la protéine B23 spécifique du compartiment granulaire du nucléole.
A l’issue de l’immunomarquage, les cellules sont incubées en présence de 4’,6’-‐ diamidino-‐2-‐phénylindole (DAPI), un intercalant de l’ADN fluorescent en bleu et qui permet donc de visualiser le noyau.
1-‐ Diméthylation de l’arginine 609/622
Dans la littérature, il a déjà été montré que la méthylation d’un motif RGG pouvait être responsable de la localisation nucléaire de protéines comme dans le cas de hnRNP A2 (Nichols et al., 2000), hnRNP K (Chang et al., 2011) ou encore hnRNP Q (Passos et al., 2006).
Afin de vérifier si la diméthylation de l’arginine 609/622 mise en évidence précédemment, pourrait également être impliquée dans la distribution nucléocytoplasmique des protéines Ilf3 et NF90, des mutants de substitution et de délétion ont été construits.
Pour simplifier les choses par la suite et faciliter la lecture, j’utiliserai le terme de diméthylation de l’« arginine 609 », afin d’éviter de répéter, à chaque fois que cette arginine sera mentionnée, « arginine 609/622 dont la numérotation correspond aux formes courtes et longues ».
Cette modification post-‐traductionnelle a lieu sur une arginine présente dans un motif consensus de type RGG (voir partie I-‐2, page 101). Dans un premier mutant, ces trois acides aminés ont été délétés (∆RGG). Les autres correspondent à des substitutions de l’arginine diméthylable en alanine (R609A) et en leucine (R609L) (acides aminés non polaires), en phénylalanine (R609F) (acide aminé mimant l’encombrement d’une arginine méthylée) et enfin en lysine (R609K) (acide aminé chargé positivement à pH neutre).
La localisation des protéines Ilf3-‐C sauvages (WT) et délétées pour le motif RGG (∆RGG) (Figure 39 et Figure 40, panneau A ; Tableau 6) ne diffère pas. Ni l’une, ni l’autre des formes ne sont retrouvées dans le nucléole comme le prouve l’absence de co-‐localisation avec B23 (Figure 40, panneau A). Cependant, elles sont bien nucléaires comme cela est observé par superposition avec la coloration au DAPI (Figure 39, panneau A).
Les images obtenues pour Ilf3-‐L WT et ∆RGG ne permettent pas de mettre en évidence de différence de localisation (Figure 39 et Figure 40, panneau B ; Tableau 6). Les protéines recombinantes sont nucléolaires (Figure 40, panneau B) comme attendu du fait de la présence à leur extrémité N-‐terminale de la séquence de localisation nucléolaire.
Les localisations de NF90-‐C WT et ∆RGG sont identiques (Figure 41 et Figure 42, panneau A ; Tableau 6). Cependant, ces protéines recombinantes sont nucléaires et plus particulièrement nucléolaire, ce qui est étonnant puisque les formes courtes endogènes de NF90 ont été montrées comme étant cytoplasmiques (Figure 30, page 63). Cette localisation pourrait s’expliquer par la surexpression de la protéine. En effet, il a été vu dans la partie I (page 89) que la quantité d’une protéine recombinante transfectée dans des cellules HeLa augmente d’un facteur 100 à 200 et que de la mort cellulaire commence à apparaître au bout de 24 à 48 heures. Les perturbations entraînées par ce très fort accroissement pourraient donc être à l’origine de la localisation nucléaire des protéines observée.
Comme précédemment, les protéines NF90-‐L WT et ∆RGG ont la même localisation subcellulaire (Figure 41 et Figure 42, panneau B ; Tableau 6), l’isoforme ∆RGG étant retrouvée dans le même compartiment que l’isoforme sauvage. Elles sont toutes deux nucléolaires du fait de la présence en N-‐terminal de la séquence de localisation nucléolaire.
Les protéines Ilf3 et NF90 délétées pour le motif RGG, qu’elles soient courtes ou longues, se localisent d’une manière identique avec la forme sauvage. Elles restent nucléaires et ne sont donc pas transférées au cytoplasme. Par conséquent, le motif RGG ne semble pas impliqué dans le processus de distribution nucléocytoplasmique de ces protéines.
A
Ilf3-C
DM1A GFP DAPI Merge
WT
"RGG
B
Ilf3-L
DM1A GFP DAPI Merge
WT
"RGG
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A
Ilf3-C
B23 GFP DAPI Merge
WT
"RG
G
B
Ilf3-L
B23 GFP DAPI Merge
WT
"RG
G
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A
NF90-C
DM1A GFP DAPI Merge
WT
"RG
G
B
NF90-L
DM1A GFP DAPI Merge
WT
"RG
G
G/B)*'! F1!J! V/4-*/2)-/,.! 4)2&'(()(%/*'! ='4! 3*,-8/.'4! AGHI! U>,*0'4! &,)*-'4! ULX! ,)! (,.B)'4U$XX!4%)E%B'4!Ui\X!,)!=8(8-8'4!UŠ@WWX!>)4/,..8'4!Y!(%!WGQf!
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A
NF90-C
B23 GFP DAPI Merge
WT
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B
NF90-L
B23 GFP DAPI Merge
WT
"RGG
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Cytoplasme Nucléoplasme Nucléole
Ilf3-C WT - ++ - ∆RGG - ++ - Ilf3-L WT - -/+ ++ ∆RGG - -/+ ++ NF90-C WT - -/+ + ∆RGG - -/+ + NF90-L WT - -/+ ++ ∆RGG - -/+ ++
Tableau 6 : Tableau récapitulatif des localisations subcellulaires observées pour les protéines Ilf3 et NF90, formes courtes (C) ou longues (L), sauvages (WT) ou délétées (∆RGG), étiquetées avec la GFP.
-‐ : aucune signal ; -‐/+ : très faible signal ; + : signal faible ; ++ : signal fort.
Les isoformes longues d’Ilf3 et de NF90 étant localisées dans le nucléole et souhaitant étudier la distribution nucléocytoplasmique des protéines Ilf3 et NF90, seuls les mutants de substitution de l’arginine diméthylable des protéines Ilf3-‐C ont été étudiés.
Lorsque l’arginine est remplacée par l’alanine (R609A), la phénylalanine (R609F), la lysine (R609K) ou encore la leucine (R609L), aucune différence de localisation avec la protéine sauvage (WT) n’a été observée (Figure 43, panneau A ; Tableau 7), les protéines restant toutes localisées au noyau. Ainsi, ni l’arginine, ni le motif RGG, substrat de la diméthylation, ne semblent impliqués dans cette fonction. Cependant, une co-‐ localisation partielle avec la protéine B23 peut être observée pour une fraction de certaines formes mutantes sans que la raison n’en soit connue pour autant (∆RGG et R609L) (Figure 44, panneau B ; Tableau 7).