Phase préanalytique : préparation de l’échantillon

Le calcul est coupé à l’aide d’un bistouri ou, lorsqu’il est très dur, d’un ciseau à bois (pour orienter le plan de coupe) et d’un marteau pour qu’il soit près à l’examen de la section à la loupe binoculaire.

Pour l’analyse infrarouge le calcul doit passer par la technique du pastillage, qui comporte plusieurs étapes :

1) prélèvement de la zone à analyser sous la loupe binoculaire à l’aide d’un scalpel ou d’une aiguille de couturière, voire d’une aiguille d’acuponcture pour les prélèvements les plus petits, et transfert de ce prélèvement dans un mortier en agate

2) addition de poudre cristalline de bromure de potassium (KBr) pur en quantité suffisante pour réaliser une dilution de l’échantillon comprise entre 0,5 et 3% dans le KBr

3) mélange homogène et finement pulvérisé de l’échantillon dans le KBr avec un pilon en agate

4) transfert du mélange pulvérisé dans un moule en acier spécial pouvant supporter une pression de 10 tonnes et permettant de confectionner des pastilles de 13 mm de diamètre. A noter que, pour les échantillons très petits comme une plaque de Randall, on peut utiliser moins de KBr et réaliser une micro-pastille de 2 ou 3 mm de diamètre

5) formation d’une pastille transparente de 0,3 à 0,7 mm d’épaisseur à l’aide d’une presse hydraulique permettant d’appliquer une pression de 10 tonnes/cm2. Pour les micro-pastilles, la pression requise est beaucoup moindre, environ 500 kg/cm2

6) transfert de la pastille dans un support spécial que l’on insère dans le compartiment de mesure d’un spectrophotomètre infrarouge à transformée de Fourier (IRTF) [81].

3.2 Phase analytique

 Analyse morphologique

L’examen optique à la loupe binoculaire a pour objet de définir la structure du calcul en fonction des caractéristiques de sa surface (texture, aspect des cristaux, couleur, particularités morphologiques comme une ombilication

papillaire avec une plaque de Randall). L’ensemble de ces éléments morphologiques peut être synthétisé sous la forme d’un (ou de plusieurs) type(s) morphologique(s).

L’examen de la section permet à la fois de déterminer la structure interne et de rechercher le point de départ de la cristallisation (noyau du calcul) qui fera l’objet d’un prélèvement spécifique pour une analyse infrarouge [81].

Cette analyse permet d’identifier la catégorie du calcul et de déterminer son type et son sous type morphologique.

Le tableau VI présente la classification morphologique des différents calculs ainsi que les principales causes à l’origine de leur constitution.

Tableau VII : Classification morphologique des calculs [81].

Type sous type Composition principales causes

I Ia, Ib, Ic, Id whewellite hyperoxalurie

II IIa IIb IIc weddellite weddellite+whewellite weddellite hypercalciurie hypercalciurie + hyperoxalurie hypercalciurie + anomalie anatomique

III IIIa, IIIb

IIIc IIId

acides uriques urates alcalins urates d’ammonium

hyperuricurie, urines acides hyperuricurie + urines alcalines infection urinaire IV IVa IVb IVc IVd carbapatite carbapatite +/- struvite struvite+carbapatite brushite

hypercalciurie, infection urinaire infection urinaire, hyperparathyroïdie infection urinaire

hypercalciurie, hyperparathyroidie primaire, diabète phosphaté, …

V Va Vb cystine cystine + carbapatite cystinurie-lysinurie congénitale cystinurie-lysinurie + phosphore VI VIa VIb VIc protéines

protéines + comp. Inf. protéines+ whewellite

pyélonéphrite chronique

origine protéique + autre cause dialyse, insuffisance rénale terminale

 Analyse constitutionnelle

Cette étape de l’analyse consiste à identifier la composition moléculaire et cristalline des différentes zones du calcul, pour ceci on fait appel à la spectrophotométrie infrarouge qui est actuellement considérée comme une méthode de référence en raison de sa polyvalence, de sa rapidité, de sa mise en œuvre aisée et de sa capacité à identifier simultanément les espèces cristallines et non cristallisées, les composants minéraux et organiques, les espèces métaboliques et médicamenteuses [81].

Principe et appareillage de la spectrophotométrie infrarouge à transformée de Fourier (IRTF)

La spectrophotométrie infrarouge est une technique d'analyse physicochimique utilisant un faisceau infrarouge qui provoque une vibration spécifique de chacune des molécules qui lui est exposée [82]. Le domaine infrarouge entre 4000 cm-1 et 400 cm-1 (2.5 – 25 μm) correspond au domaine d'énergie de vibration des molécules.

Lorsque la longueur d'onde (l'énergie) apportée par le faisceau lumineux est voisine de l'énergie de vibration de la molécule, cette dernière va absorber le rayonnement et on enregistrera une diminution de l'intensité réfléchie ou transmise.

Toutes les vibrations ne donnent pas lieu à une absorption. Pour une géométrie donnée on peut déterminer les modes de vibration actifs en infrarouge

Au moyen d'un traitement algorithmique (transformée de Fourier), ces vibrations se traduisent par la construction d'un spectre dont les bandes d'absorption correspondent à la présence spécifique d'une ou de plusieurs molécules. Ainsi, la spectrométrie infrarouge est utilisée pour l'analyse qualitative, quantitative et surtout globale de plusieurs composés biologiques à la fois [82].

Le spectrophotomètre à transformée de Fourier est composé de (Figure 37):

 Une source

 Un interféromètre de Michelson  L’échantillon

 Un détecteur

Le faisceau infrarouge provenant de la source est dirigé vers l'interféromètre de Michelson, qui va moduler chaque longueur d'onde du faisceau à une fréquence différente. Dans l'interféromètre le faisceau lumineux arrive sur la Séparatrice. La moitié du faisceau est alors dirigée sur le miroir fixe, le reste passe à travers la séparatrice et est dirigé sur le miroir mobile. Quand les deux faisceaux se recombinent, des interférences destructives ou constructives apparaissent en fonction de la position du miroir mobile. Le faisceau modulé est alors réfléchi des deux miroirs vers l'échantillon, où des absorptions interviennent. Le faisceau arrive ensuite sur le détecteur pour être transformé en signal électrique [16].

Le signal du détecteur apparaît comme un interférogramme, c'est à dire une signature de l'intensité en fonction de la position du miroir. L'interférogramme est la somme de toutes les fréquences du faisceau.

3.3 Phase post-analytique

L’interprétation du spectre se fait par comparaison aux spectres de référence et en tenant compte des bandes caractéristiques et bandes clés, elle permet de caractériser chaque espèce présente dans le calcul [84].

Les figures 38 et 39 montrent un spectre type pour chaque espèce lithogène, les flèches indiquent l’emplacement des principales bandes caractéristiques.

Figure 38 : spectre infrarouge d’un calcul d’acide urique anhydre [27].