La phase analytique

4.2.1. L’examen macroscopique du LCR (22)

- Un liquide clair nommé souvent eau de roche, correspond à un liquide normal ou pathologique (cas des méningites virales, tuberculeuses, mycosiques et leptospires) ; - Un liquide trouble ou purulent (eau de riz), correspond à une réponse leucocytaire

marquée, traduisant généralement une méningite bactérienne, ou plus rarement une réaction méningée inflammatoire microbienne ;

- Un liquide hématique est rencontré en cas de piqûre de l’un des vaisseaux au cours de la PL, plus marqué dans le premier tube que dans le dernier avec souvent formation d’un petit caillot ;

- Un liquide sanglant ou jaune (anciennement appelé xanthochromique), dans les trois tubes, évoquant une hémorragie méningée, sans toutefois éliminer systématiquement une méningite.

4.2.2. L’examen cytologique du LCR

L’analyse cytologique a pour rôle d’étudier le nombre et le type des cellules présentes dans le LCR. Elle nécessite un prélèvement d’un minimum de 500µL de LCR (146). Ce volume minimum est important à respecter puisqu’il conditionne la proportion de faux négatifs. En effet, le taux de faux négatifs diminue lorsque le volume analysé augmente.

Après réception au laboratoire, l’échantillon est traité le plus rapidement possible. Celui-ci est homogénéisé par une dizaine de retournements manuels lents. Les éléments cellulaires (leucocytes, hématies) sont dénombrés dans une cellule quadrillée ou hématimètre conventionnel réutilisable de type cellule de Nageotte ou de Malassez ou à usage unique. Avant comptage des hématies et des éléments nucléés, il convient de laisser se déposer les éléments dans la chambre de comptage 3 à 5 minutes (147).

La formule cytologique est réalisée, après un enrichissement cellulaire soit par centrifugation à 1000 tours/minutes soit par centrifugation sur Cytospin Shandon avec addition de quelques gouttes d’une solution de protéines à 600 tours/minute pendant 6 minutes, sur le frottis fixé à l’air et coloré au May Grünwald Giemsa (MGG) (148).

Le résultat est exprimé en nombre de leucocytes et d’hématies par mm³.

4.2.3. Le dosage des protéines totales dans le LCR

Les méthodes turbidimétriques, méthode à l’acide sulfosalicylique à 3%, à l’acide trichloracétique à 3%, ont été progressivement abandonnées en raison de la réactivité variable des protéines vis-à-vis des réactifs. Par la suite, ce sont les méthodes colorimétriques automatisables tel qu’au rouge de Pyrogallol qui ont été utilisées. Cette méthode repose sur l'action du complexe Rouge de Pyrogallol-Molybdate sur les protéines qui se traduit par une réaction colorée. Le maximum d'absorption passe alors de 467 nm à 598 nm. La densité optique mesurée à 598 nm est proportionnelle à la concentration de la solution en protéines. Actuellement, les techniques turbidimétriques au chlorure de benzéthonium commencent à être de plus en plus utilisés (149).

4.2.4. L’examen immunologique du LCR

Dans le cadre du diagnostic de la SEP, les conférences de consensus ont établit une liste de recommandations sur l’examen immunologique du LCR afin d’affimer l’origine inflammatoire des anomalies du SNC (150) (151). Celui-ci est réalisé sur le couple LCR-sérum d’un même patient. La mise en évidence d’une SI d’Ig peut se faire soit par (152)(153) :

- Une analyse quantitative des IgG (voire A et M) et de l’albumine présentes dans le LCR comparativement au sérum. Ce dosage a pour objectif d’évaluer à la fois l’état de perméabilité de la BHE, ainsi qu’une éventuelle SI. La mise en évidence de la SI se fait par calcul de l’Index IgG et son interprétation selon le diagramme de Reiber ;

- Une analyse qualitative à la recherche de BOC d’Ig (principalement les IgG) par isoélectrofocalisation (IEF), technique de référence. En effet, le diagnostic de réaction inflammatoire repose essentiellement sur la mise en évidence d’une distribution oligoclonale des Ig du LCR. Chez les personnes atteintes de SEP, ces bandes ne sont pas présentes dans leur sérum, montrant ainsi une SI d’Ig et donc un processus inflammatoire limité au SNC.

4.2.4.1. Les techniques quantitatives

La mesure des taux d’IgG et d’albumine dans le LCR et le sérum se fait en parallèle par les mêmes techniques immunologiques : immunonéphélémétrie cinétique ou immunoturbidimétrie. Le dosage permet le calcul des index de production locale et de rupture de la barrière hémato-méningée (BHM) (154). Il est à savoir que la fiabilité des techniques quantitatives peut baisser même dans le cas d’une faible contamination sanguine (155).

Ces méthodes mettent en œuvre la précipitation de la protéine à doser par son anticorps spécifique (immunoprécipitation). Les complexes antigènes-anticorps ainsi formés en solution peuvent disperser la lumière de façon considérablement plus importante que les antigènes ou anticorps libres, et ceci avec une intensité proportionnelle (sous certaines conditions) au nombre de complexes (Figure 28). Les longueurs d'ondes utilisées varient entre 250 et 350 nm. La mesure de la lumière diffusée est effectuée à 90° par rapport à la lumière incidente (156). La néphélémétrie et la turbidimétrie sont des techniques voisines mais la néphélémétrie est considérée comme la technique de référence.

4.2.4.2. Les techniques qualitatives

La SI d’IgG est mise en évidence par la présence de BOC d’IgG spécifiques au LCR. Plusieurs méthodes de détection des BOC, de sensibilité et spécificité variables, sont disponibles. Le principe est le même : après ajustement de leur concentration en IgG, les échantillons du LCR et du sérum sont déposés côte à côte pour une comparaison fiable des profils de répartition des IgG (155).

- Electrophorèse sur agarose haute résolution

L’électrophorèse est une technique de séparation des molécules chargées sous l’influence d’un champ électrique. La migration des particules dépend de leur charge influencée par un pH donné (utilisation d’une solution tampon) et de leur taille. C’est ainsi que les protéines ayant toutes la même charge, procèdent à une migration électrophorétique à travers les mailles du gel et vont être séparées en fonction de leur taille. Après la migration, le gel est ensuite fixé dans une solution alcooloacétique, puis une étape de coloration et séchage est réalisée. Cette technique de séparation nécessite une concentration au préalable du LCR (152) (158) (159).

- Immunofixation comparative du couple LCR/sérum (159) (160) (161)

Cette technique adaptée aux LCR non concentrés, est réalisée sur gel d’agarose HYDRAGEL 6 CSF de Sebia, après électrophorèse haute résolution, sur le semi-automate Hydrasis Sebia. L’immunofixation comporte par ailleurs une étape manuelle qui consiste à ajuster les concentrations en IgG du LCR et du sérum à 10mg/L par dilution puis à les déposer sur un gel d’agarose à 0,8%. Par la suite, une migration électrophorétique s’effectue pendant 17 minutes à 10 Watt. Elle est réalisée ensuite sur le semi-automate par incubation avec l’immun sérum caprins conjugué à la peroxydase (anti-G, anti-kappa, anti-lambda) pendant 10 minutes. La révélation des complexes IgG/anti-IgG se fait directement dans le gel par le réactif TTF3 (substrat de la peroxydase) en présence d’eau oxygénée.

- Isoélectrofocalisation du couple LCR/sérum avec immunorévélation des IgG (IEF) (152) (159) (162) (163)

En complément à l’immunofixation des IgG, l’IEF est une méthode réalisée sur gel d’agarose ou de polyacrylamide qui consiste à séparer des protéines en fonction de leur point isoélectrique, dans un gradient de pH créé par des ampholytes de pH 3.5 à 10. Celle-ci

comporte une étape de dilution du sérum afin d’obtenir une même concentration d’IgG et du LCR. Ensuite, à l’aide d’une micropipette, un volume de 5µl de LCR et du sérum est déposé sur la surface du gel à 2 centimètres de l’anode. La migration est effectuée sous un voltage maximum de 2000 volts et 15 watts maximum à 15°C pendant 37 minutes.

Le point isoélectrique d’une protéine dépend à la fois de la séquence protéique et de la glycosylation. Au point isoélectrique, sous un fort voltage, la charge globale des protéines est nulle. Elles s’immobilisent dans le gel en bandes plus ou moins fines.

L’immunorévélation des IgG peut se faire selon 3 procédés :  Immunofixation des IgG directement dans le gel ;

 Sur membrane de nitrocellulose (Figure 29) ou de polyvinylidene difluoride (PVDF-P) après un transfert passif ;

 Sur membrane après immunotransfert.

Figure 29: La technique d’isoélectrofocalisation suivie d’une immunorévélation des IgG sur membrane de nitrocellulose (154)

L’immunsérum révélateur des IgG peut être conjugué à la peroxydase ou à la biotine après amplification par le complexe streptavidine-phosphatase alcaline.

Plusieurs techniques sont aujourd’hui commercialisées : soit manuelles réalisées à l’aide de coffrets réactifs sur des ensembles modulaires spécialisés pour focalisation (IgG-IEF Helena Biosciences, Amersham) soit semi-automatisées (HYDRAGEL 3CSF ou 9CSF ISOFOCUSING Sebia, PhastSystem Amersham Biosciences).