Perspectives

La d´emonstration sur ce syst`eme mod`ele, impliquant une prot´eine de struc-ture connue, que la mesure du froissage de la membrane active permet de remon-ter au dipˆole de force, nous permettra par la suite d’utiliser cette technique sur des prot´eines membranaires pour lesquelles l’amplitude des changements confor-mationnels n’est pas connue comme les r´ecepteurs, les canaux ioniques et les transporteurs multi-drogues ABC (transportant une large vari´et´e de substrats :

ions, m´etaux lourds, drogues anticanc´ereuses, st´ero¨ıdes, glucocortico¨ıdes, acides biliaires, mycotoxines, antibiotiques et peptides). Par exemple, dans le cas des transporteurs ABC, deux types de changements conformationnels sont envisag´es au cours du transport, l’un de grande amplitude passant d’une position ouverte en forme de “V” `a une position ferm´ee en forme de “I” (voir Fig. V.14) engen-drant des effets importants sur le solvant [Chang, 2003], et l’autre de plus faible amplitude (voir Fig. V.15) avec un transport s’effectuant par un m´ecanisme de type « flippase » [Locher et al., 2002, Bass et al., 2003]. La mesure de l’effet de l’activit´e de ces transporteurs ABC sur le froissage de la v´esicule, `a condition que l’on puisse reconstituer ces prot´eines dans des liposomes g´eants, pourrait, en toute rigueur, trancher entre ces deux types de m´ecanismes. Mais il faut tout de mˆeme rester prudent quant au lien entre les effets collectifs, que nous mesu-rons ici avec la technique des micropipettes, et les effets `a l’´echelle mol´eculaire, auxquelles nous remontons grˆace au mod`ele th´eorique.

Fig. V.14 - Vues sch´ematiques de la structure de MsbA, un transporteur ABC, dans ses configurations ouverte en forme de “V” (`a gauche) et ferm´ee en forme de “I” (`a droite). La position approximative de la membrane est repr´esent´ee par des traits continus noirs. Adapt´e de [Chang, 2003].

Fig. V.15 - M´ecanisme sch´ematique du transporteur BtuCD, un transporteur ABC. `A gauche est repr´esent´e l’´etat du transporteur o`u le nucl´eotide est libre.

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A droite est propos´e un r´earrangement conformationel de faible amplitude pour transporter la vitamine B12. Adapt´e de [Locher et al., 2002].

Les membranes biologiques sont des objets tr`es complexes : lorsque l’on cherche `a les ´etudier du point de vue du physicien, on est forc´ement limit´e `a des mod`eles tr`es simplifi´es. Ces mod`eles ont ´et´e utilis´es de mani`ere intensive pour d´ecrire les propri´et´es d’´equilibre des membranes. Pourtant, une descrip-tion physique plus compl`ete des membranes doit tenir compte des ph´enom`enes hors-´equilibres caract´eristiques des membranes biologiques. Nous nous sommes int´eress´es dans la majorit´e de ce travail `a l’influence de ph´enom`enes hors-´equilibres sur les fluctuations de forme de membranes. Le rˆole des fluctua-tions thermiques peut paraˆıtre secondaire d’un point de vue biologique. Il n’est d’ailleurs pas ´evident que les concepts d´evelopp´es ici jouent un rˆole im-portant dans les syst`emes biologiques. La probl´ematique est donc essentielle-ment une probl´ematique physicienne. Le choix d’´etudier les fluctuations a ´et´e motiv´e par son importance th´eorique et par le grand nombre d’outils tant th´eoriques qu’exp´erimentaux `a notre disposition pour les traiter. Nous avons montr´e que la physique des fluctuations d’une membrane hors-´equilibre est compl`etement diff´erente de celle d’une membrane `a l’´equilibre thermodynamique. Pour cela, nous nous sommes appuy´es sur des mod`eles th´eoriques et des tech-niques exp´erimentales simples et originaux. `A partir de questions inspir´ees direc-tement de la biologie, nous avons construit un probl`eme de physique statistique qui renouvelle la question des fluctuations de membranes.

Dans le chapitre III, est expos´e le mod`ele th´eorique des « membranes actives » [Prost and Bruinsma, 1996, Ramaswamy et al., 2000] que nous avons adapt´e au cas des pompes incorpor´ees dans la membrane. Ce mod`ele pr´edit entre autre l’amplification des fluctuations par l’activit´e hors-´equilibre de la membrane. Pour v´erifier ces pr´evisions th´eoriques, nous avons choisi un mod`ele assez simple `a sa-voir une prot´eine transmembranaire, l’ATPase-Ca2+. Toute la difficult´e a ´et´e de mettre au point un protocole exp´erimental pour reconstituer, de mani`ere contrˆol´ee et non invasive, cette prot´eine dans la membrane de v´esicules g´eantes unilamel-laires tout en pr´eservant son activit´e. Nous avons d´evelopp´e un tel protocole de reconstitution qui se d´ecompose en trois phases (chapitre IV) : (i) reconstitution

des prot´eines dans des petits prot´eoliposomes, puis (ii) s´echage partiel sous at-mosph`ere contrˆoll´ee, et enfin (iii) ´electroformation des v´esicules g´eantes. Nous avons alors ´etudi´e les caract´eristiques de ce syst`eme en termes de morphologie, d’unilamellarit´e, d’homog´en´eit´e de prot´eines reconstitu´ees et d’activit´e (hydro-lytique et de pompage). Ce protocole appliqu´e `a l’ATPase-Ca2+ a ´et´e efficace dans une large gamme de concentrations de prot´eines (avec des rapports mo-laires lipide/prot´eine compris entre 480 et 5500) et reproductible. Par rapport aux autres protocoles d´ecrits dans la litt´erature, le notre rem´edie `a la plupart de leurs d´efauts : les v´esicules sont suffisamment grosses pour ˆetre manipulables et observables par les techniques optiques, nous n’incorporons pas dans la membrane d’agents comme les peptides de fusion qui fausseraient les mesures que nous vou-lons effectuer, nous contrˆovou-lons assez bien la quantit´e de prot´eines reconstitu´ees, nous n’observons pas d’agr´egats de prot´eines. La seule contrainte impos´ee par la technique d’´electroformation est le fait que nous devons travailler `a basse force ionique.

Disposant de ce syst`eme « actif » (ou plus exactement activable), nous avons logiquement observ´e l’effet du pompage de l’ATPase-Ca2+sur les fluctuations de forme des v´esicules. `A cette fin, nous avons utilis´e la technique d’aspiration des mi-cropipettes (chapitre V) qui int`egre tous les modes de fluctuations d’une v´esicule et donc quantifie l’amplitude de ces fluctuations. Ces exp´eriences ont pu mettre en ´evidence deux effets importants. D’une part, lorsque la prot´eine n’est pas activ´ee, nous avons observ´e une diminution du module de courbure li´e `a l’incor-poration de prot´eines dans la membrane permettant une mesure du coefficient de couplage entre la courbure moyenne et la concentration de prot´eines. C’est la premi`ere fois qu’une telle mesure a pu ˆetre faite sur le syst`eme v´esicule-prot´eine et de mani`ere aussi contrˆol´ee. D’autre part, nous avons constat´e une augmen-tation de l’exc`es de surface dˆu aux fluctuations lors du pompage de calcium et, de fait, nous avons montr´e que l’activit´e biologique hors-´equilibre a un effet im-portant sur les fluctuations des membranes. Ces r´esultats sont en bon accord avec les pr´edictions th´eoriques et l’origine hors-´equilibre des effets observ´es a ´et´e d´emontr´ee de mani`ere explicite. La comparaison quantitative entre th´eorie et exp´erience a permis une mesure raisonnable du dipˆole de force Pa de 8 - 9× kBT. Dans le chapitre III, nous avons ´etabli un mod`ele solide et g´en´eral permet-tant de rendre compte des ´echanges de mat´eriels biologiques (lipides, enzymes, etc.) entre la membrane et le fluide environnant, et nous l’avons ´etudi´e dans le cas d’une membrane plane proche de l’´equilibre. Malgr´e la relative simplicit´e de cette situation, les calculs analytiques ne sont pas ´evidents notamment parce que le probl`eme est non-local et non-lin´eaire. Nous avons montr´e que la membrane plane pr´esente une instabilit´e morphologique pour des valeurs particuli`eres des coefficients cin´etiques et que la pression osmotique joue un rˆole important dans l’apparition de cette instabilit´e. Une analyse lin´eaire rend compte d’instabilit´es tubulaires dans la membrane qui s’apparenteraient `a ce qui est observ´e par J. So-lon (´equipe de P. Bassereau) [SoSo-lon, 2004]. La comparaison entre les observations

et le mod`ele th´eorique, adapt´e `a cette situation, semble en assez bon accord sur quelques points. En effet, les r´esultats exp´erimentaux semblent confirmer le fait que l’instabilit´e soit d´eclench´ee par le changement de signe de la tension effective de la v´esicule (qui devient n´egative) comme le pr´edit notre mod`ele. Celui-ci rend donc bien compte des premi`eres ´etapes de processus qui s’apparentent `a l’exocy-tose. Mais il reste encore beaucoup `a faire pour connaˆıtre et comprendre tous les m´ecanismes physiques entrant en jeu dans ce type de syst`emes.

Un autre cas d’´etude int´eressante et qui constitue un prolongement de ce mod`ele th´eorique est le film lipidique suspendu s´eparant deux milieux de concen-trations salines diff´erentes. Les effets de bords auraient pour cons´equence d’in-duire des ´echanges de lipides d’une part entre les bords et le reste de la membrane, et d’autre part entre les bords et le fluide. Cette ´etude est actuellement en cours de traitement dans notre ´equipe.

Annexe

A

El´ements de g´eom´etrie

diff´erentielle

Dans cette annexe, nous allons tout d’abord introduire les notions li´ees `a la description math´ematique des surfaces courb´ees ainsi que leurs propri´et´es g´en´erales. Pour obtenir le d´etail complet de ces r´esultats, je vous renvoie aux trait´es de g´eom´etrie diff´erentielle de M. Do Carmo [do Carmo, 1976] et de F. David ([Nelson et al., 1989, p.158-223]). Puis dans la seconde section, nous utili-serons ces concepts pour exprimer les d´eriv´ees fonctionnelles des diff´erents termes de l’´energie par rapport `a la position de la membrane.

A.1 Introduction