Particules ultrafines

Afin d’exposer les cellules BEAS-2B aux PUF retenues sur les filtres en fibres de verre, deux types d’échantillons composites de PUF ont été préparés pour chaque site d’échantillonnage : un extrait organique et un extrait de particules récupérées dans de l’eau. D’abord, nous citons brièvement les différents protocoles utilisés dans la littérature, ensuite nous

98 passons à la présentation des protocoles que nous avons utilisés pour préparer les échantillons composites de PUF pour les études de toxicologie.

2.1. Protocoles utilisés dans la littérature

Afin de pouvoir exposer des cellules aux particules retenues sur des filtres, différentes méthodes sont citées dans la littérature et sont utilisées, telles que l’extraction de la fraction organique, de la fraction soluble ou de la fraction insoluble des particules, ou la récupération des particules totales retenues sur les filtres. Dans ce paragraphe, nous résumons les méthodes utilisées pour récupérer les grosses particules, les fines et les ultrafines à partir de différents types de filtre.

Afin d’exposer les cellules à la fraction organique des PM retenues sur des filtres en fibre de verre ou en nitrocellulose, une extraction des composés organiques dans un solvant a été réalisée. Les filtres ont été extraits soit dans du dichlorométhane au soxhlet (Cavanagh et al., 2009 ) ou par la technique Accelerated Solvent extraction (ASE) (Baulig et al., 2009), soit dans de l’acétone par ultrasons (Schirilo et al., 2010). Les extraits ont été ensuite concentrés sous flux d’azote ou par évaporateur rotatif, et repris dans du Diméthyl Sulfoxide (DMSO) (Baulig et al., 2009 ; Cavanagh et al., 2009 ) ou dans du milieu de culture (Schirilo et al., 2010).

Concernant l’exposition des cellules à la fraction soluble ou insoluble des particules, ou aux particules totales retenues sur différents types de filtre, une première étape est couramment réalisée par traitement du filtre aux ultrasons dans de l’eau (den Hartigh et al., 2010 ; Gualtieri et

al., 2009 ; Hutchison et al., 2005 ; Li et al., 2009 ; Lu et al., 2011 ; Manteca et al., 2010 ; Nawrot et al., 2009 ; Schins et al., 2004) ou du méthanol (Happo et al., 2007 ; Jalava et al., 2010 ; Jalava et al., 2007 ; Jalava et al., 2006 ; Pennanen et al., 2007 ).

Les fractions soluble ou insoluble des particules récupérées, ont été ensuite obtenues en récupérant respectivement le surnageant (Baulig et al., 2009 ; Hutchison et al., 2005) ou le culot de particules (Hutchison et al., 2005) après les avoir fait sédimenter par centrifugation. Quant aux particules totales, la suspension des particules, obtenues suite au traitement des filtres aux ultrasons, a été concentrée (Jalava et al., 2010 ; Jalava et al., 2006 ; Pennanen et al., 2007) ou séchée dans un dessiccateur. Dans le dernier cas, les particules sont ensuite remises en suspension dans de l’eau (Gualtieri et al., 2009)

99 D'autres auteurs, ont choisi d’éliminer les fibres détachées du filtre en fibre de verre en filtrant, sur un filtre d’acétate de cellulose 0,2 µm, la solution de particules obtenue après traitement du filtre aux ultrasons (Happo et al., 2007 ; Jalava et al., 2006 ; Pennanen et al., 2007).

Le problème se pose également de savoir quelle est la masse de particules récupérée par ce protocole, et différentes méthodes sont utilisées pour cette détermination. den Hartigh et al., 2010, Li et al., 2009 et Lu et al., 2011 ont déterminé la masse des particules récupérées, par la différence des masses des filtres, en téflon ou polycarbonate, avant et après récupération des particules. D’autres, ont déterminé la concentration des particules par turbidimétrie (Baulig et al., 2003 ; Schins et al., 2004 ; Shi et al., 2006) ou par la pesée des particules récupérées après séchage au dessicateur (Gualtieri et al., 2009 ; Manteca et al., 2010 ). Par contre, Happo et al., 2007, Jalava et al., 2006 et Schirilo et al., 2010 ont calculé la masse des particules retenues sur les filtres en fibre de verre par la pesée du filtre avant et après échantillonnage et ils ont supposé que toutes les particules retenues sur les filtres ont été récupérées. Plusieurs auteurs sont par ailleurs d'accord pour dire que l’efficacité d’extraction ne peut pas être mesurée pour les PM0,2

collectées sur des filtres en fibre de verre (Happo et al., 2007 ; Jalava et al., 2007 ; Schirilo et al., 2010).

Quant à la composition chimique des particules, elle est déterminée soit en analysant des morceaux du même filtre à partir duquel les particules ont été récupérées pour réaliser les analyses toxicologiques (Hutchison et al., 2005 ; Li et al., 2009 ; Nawrot et al., 2009 ), soit en analysant un autre type de filtre qui a été collecté en parallèle avec le filtre qui a servi pour récupérer les particules (Manteca et al., 2010), soit en analysant les particules récupérées après leur séchage (Jalava et al., 2006 ; Pennanen et al., 2007).

2.2. Extraits organiques des composites de PUF

Les extraits organiques des échantillons composites de PUF-U et de PUF-R retenues sur des filtres et qui vont servir pour les analyses de toxicologie sont préparés de la manière suivante : les filtres des composites de PUF-U (1/12 de chaque filtre U1, U2, U3, U4 et U5) et de PUF-R (1/12 de chaque filtre R6, R8 et R9) sont extraits dans du dichlorométhane au soxhlet pendant 16 h. Les extraits sont ensuite concentrés sous flux d’azote jusqu’à environ 2 microlitres puis repris dans 200 µL de DMSO. La même procédure a été réalisée pour une quantité équivalente d’un filtre vierge.

100

2.3. Récupération des PUF retenues sur les filtres d’arrêt

Après plusieurs essais de récupération de PUF à partir du filtre en fibre de verre, et dans la mesure où un protocole standard n'existe pas et que les protocoles utilisés dans la bibliographie divergent, nous avons établi notre propre protocole en nous inspirant de ceux présents dans la bibliographie. La méthodologie utilisée fait appel à une récupération des particules par ultrasons, tous les auteurs étant d'accord sur ce point, à une filtration pour éliminer les fibres détachés du filtre, et à une étape de concentration à l'aide d'un "speed-vac". Les moitiés des filtres de PUF-U (1, 2, 3, 4 et 5) et de PUF-R (6, 8 et 9) ont été utilisées pour récupérer dans l’eau les particules ultrafines, et pour former les échantillons composites de PUF-U et de PUF-R respectivement. La Figure II-8 résume ce protocole qui est détaillé dans le paragraphe ci-dessous.

La moitié du filtre d’arrêt de chaque échantillon est pesée puis coupée en 14 morceaux environ. Chaque morceau est mis dans un tube en polypropylène de 50 mL (déjà lavé 3 fois à l’eau ultra pure par ultrasons) et couvert de l’eau ultra pure puis soumis aux ultrasons pendant 20 min à 18ºC. Après le traitement aux ultrasons, le morceau de filtre est rincé légèrement à l’eau ultra pure et la solution obtenue est filtrée sur un filtre de polycarbonate (diamètre des pores 0,45 µm ; diamètre du filtre 47 mm) Sartorius AG à l’aide d’un système de filtration (déjà lavé à l’acide puis à l’eau ultra pure) et d’une pompe à vide manuelle Nalgene®

. Cette étape est indispensable pour retenir les fibres détachées du morceau du filtre lors de l’ultrason. Après chaque filtration, le filtre de polycarbonate (qui a servi pour la filtration) est rincé à l’eau ultra pure afin de ne pas perdre les particules retenues avec les fibres. La même procédure est répétée une 2^ème fois avec le même morceau de filtre (back-up). Afin de récupérer les particules qui peuvent être retenues sur le filtre de polycarbonate après la filtration, la même procédure est appliquée une fois pour ce filtre.

Les filtrats issus des différents morceaux de filtre d’un même échantillon, et contenant les particules récupérées, sont groupés, puis l’eau est évaporée par l’intermédiaire d’un speed-vac (RVC 2-25 CD plus, Christ) (conditions: 60ºC ; sous-vide : 24 mbar ; 1300 tours/min), qui est un évaporateur centrifuge utilisé pour évaporer les solvants de plusieurs échantillons simultanément (Zhao et al., 2012).

101 Figure II-8 : Schéma du protocole de récupération des particules ultrafines à partir du filtre d’arrêt.

Les masses des PUF retenues sur les filtres d’arrêt ont été déterminées en additionnant les concentrations déterminées pour l'ensemble des éléments analysés présents dans les particules collectées sur ces filtres (éléments majeurs et mineurs, ions inorganiques et carbone total).

Après le traitement au speed-vac, les solutions des échantillons de PUF-U (1, 2, 3, 4 et 5) d’une part, et de PUF-R (6, 8 et 9) d’autre part sont mélangées afin de former les échantillons composites de PUF-U et de PUF-R récupérées dans l’eau. Les solutions d’échantillons composites sont ensuite concentrées par le speed-vac de façon à avoir une concentration finale de 5 mg de PUF/mL et elles sont enfin stockées dans des tubes en polypropylène à -20ºC jusqu’à

Ultrasons 1

Rinçage du filtre

Morceau de filtre + eau ultra pure

Morceau de filtre + eau ultra pure Renouvellement

de l’eau 20 min ; 18ºC

Ultrasons 2 20 min ; 18ºC

Filtration des solutions contenant les PUF

Ultrasons

Filtre de polycarbonate + eau ultra pure

20 min ; 18ºC

Filtration Système de

filtration sous vide

Système de filtration sous vide Concentration des filtrats

(de tous les morceaux du filtre) par speed-vac

Stockage à -20ºC Filtre de polycarbonate

0,45 µm Filtre d’arrêt

102 leur utilisation ultérieure. Cette concentration est déterminée en considérant que toutes les particules qui étaient sur les filtres sont récupérées dans l’eau (Hutchison et al., 2005 ; Jalava et

al., 2006 ; Schirilo et al., 2010).

Un filtre en fibre de verre vierge a subi la même procédure, et le filtrat obtenu est concentré de façon à avoir une quantité équivalente à celle des échantillons composites de PUF-U et de PPUF-UF-R. Ce dernier extrait sera utilisé en témoin pour les études de cytotoxicité.

103

Partie C :

Caractérisation physico-chimique des

particules

L’ensemble des échantillons individuels cités dans le Tableau II-2, soit 18 échantillons, ainsi que les échantillons composites de PF-U et de PF-R, ont subi différentes analyses chimiques afin de déterminer leurs compositions et d’identifier leurs caractéristiques. Le principe, le protocole et les conditions opératoires des différentes techniques utilisées sont développés dans cette partie.

Avant chaque analyse, les échantillons de particules fines (poudre) et de particules ultrafines (sur filtres) ont été mis à température ambiante pour 3 heures. Les PF ont été ensuite homogénéisées par vortex avant de prélever la masse désirée de particules pour effectuer l’analyse. Quant aux filtres d’arrêt, avant la première analyse, les contours (partie du filtre en contact avec le joint et ne retenant pas de particules) ont été coupés et éliminés et les parties de filtres chargées de particules ont été ensuite pesés. Chaque analyse a été réalisée sur une portion de filtre préalablement pesée. La stratégie de travail et les différentes informations auxquelles l’on souhaite accéder sont représentées dans la Figure II-9.

104 Figure II-9 : Stratégie de travail

Prélèvement des particules

Echantillons individuels Composite PF-U Particules ultrafines Site Urbain

PF-U₁ PF-U₂ PF-U₃ PF-U₄ PF-U₅

Site rural

PF-R₆ PF-R₇ PF-R₈ PF-R₉

Site Urbain

PUF-U₁ PUF-U₂ PUF-U₃ PUF-U₄ PUF-U₅

Site rural

PUF-R₆ PUF-R₇ PUF-R₈ PUF-R₉

Particules fines Echantillons individuels Composite PF-R Echantillons individuels Echantillons individuels Composite PUF-U (1 à 5) Composite PUF-R (6, 8, 9) Eléments inorganiques (4 mg) Ions Inorganiques (7 mg) Carbone total (2 mg) HAP (10 mg) Eléments inorganiques (1/17 filtre) Ions Inorganiques (1/17 filtre) Carbone total (1/200 filtre) HAP (1/8 filtre) PCDD, PCDF et PCB 1/30 de chaque filtre PCDD, PCDF et PCB 1/30 de PUF-R (6, 8 et 9) Extrait organique PUF-U 1/12 de chaque filtre 1/2 de chaque filtre Récupération dans l’eau PUF-U Extrait organique PUF-R 1/12 de PUF-R (6, 8, et 9) 1/2 de PUF-R (6, 8 et 9) Récupération dans l’eau PUF-R Etudes toxicologiques R6, 8 et 9 PCDD, PCDF et PCB (10 mg) Granulométrie (1 mg) Surface spécifique (10 mg) Eléments inorganiques (4 mg) Ions Inorganiques (7 mg) Carbone total (2 mg) PCDD, PCDF et PCB (10 mg) Granulométrie (1 mg) Surface spécifique (10 mg) HAP (10 mg) Eléments inorganiques (1/17 filtre) Ions Inorganiques (1/17 filtre) Carbone total (1/200 filtre)

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