Détermination de la cytotoxicité globale

La détermination de la cytotoxicité des particules atmosphériques collectées au Liban consiste à exposer les cellules BEAS-2B à différentes concentrations de particules pendant différents temps d’exposition afin d’évaluer leur toxicité par l’intermédiaire de deux tests complémentaires de cytotoxicité.

Rappelons que pour les analyses toxicologiques, seuls les échantillons composites de particules (des deux origines : urbaine et rurale) ont été utilisés. Donc pour les particules fines, deux échantillons ont été étudiés : le composite de PF-U et celui de PF-R. Quant aux particules ultrafines, deux types d’échantillons composites ont été utilisés pour chaque site : les composites de PUF-U et de PUF-R récupérées dans l’eau ainsi que leurs extraits organiques.

Les tests de cytotoxicité ont été réalisés dans des microplaques de culture à 96 puits (Corning^® CellBIND^®, ThermoFisher Scientific ; Illkirch, France) et les cellules ont été ensemencées de manière homogène (100 µL/puit) de façon à avoir le jour du test environ 4x10⁴ cellules/puit.

2.1.1. Particules fines

La cinétique d’exposition choisie était de 24, 48 et 72h. Cette cinétique nous a conduit à utiliser 3 plaques pour chaque échantillon de PF. Les cellules ont été exposées à 7 concentrations différentes de PF : 1,5 ; 3 ; 6 ; 12 ; 24 ; 48 et 96 µg/cm² (volume final est de 200 µL/puit). En effet, une solution mère de 96 µg de particules /cm² a été préparée dans du milieu de culture en homogénéisant la préparation par traitement aux ultrasons. Des dilutions successives ont été réalisées à partir de la solution mère afin d’obtenir la gamme de concentrations voulue. Le schéma des plaques dans le cas des particules fines est représenté dans la Figure II-12.

125 Figure II-12 : Schéma de microplaque pour l’étude de la cytotoxicité des particules fines.

Dans chacune des microplaques, chaque condition a été représentée par 8 puits (8 réplicats par condition) à l’exception du témoin négatif, où 16 puits ont été ensemencés par des cellules BEAS-2B dans du milieu de culture en l’absence de polluant. De plus, 8 puits contenant des cellules ont été exposés au triton X100 (concentration finale de 1 %) et ont servis de témoins positifs de mortalité. D’autre part, les puits des deux premières colonnes de chaque microplaque contiennent respectivement du milieu de culture seul ou additionné de PM à 96 µg/cm² en suspension dans du milieu de culture.

2.1.2. Particules ultrafines

Dans le cas des échantillons composites de PUF-U et de PUF-R récupérées dans l’eau, les cellules ont été exposées à la gamme de concentrations suivante : 0,375 ; 0,75 ; 1,5 ; 3 ; 6 ; 12 ; 24 ; 48 et 96 µg/cm² selon une cinétique de 24, 48 et 72 h. Tandis que, pour les extraits organiques de PUF-U et de PUF-R, une cinétique d’exposition de 24, 48 et 72 h a été étudiée pour une gamme de concentration de 0,003 ; 0,006 ; 0,125 ; 0,025 ; 0,05 ; 0,1 ; 0,2 ; 0,4 et 0,8 ng

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Mil ie u Mil ie u + P M Témo in -1 ,5 µg /c m 2 3 µg /cm 2 6 µg /c m 2 12 µg /c m 2 24 µg /c m 2 48 µg /cm 2 96 µg /c m 2 Trit o n 1 %

126 d’HAP/cm2

. Cette dernière gamme a été choisie de façon à couvrir les teneurs en HAP présentes dans 3 µg/cm² et 12 µg/cm² de PF-U (le choix de ces deux dernières concentrations de PF, sera détaillé ultérieurement). Un schéma de plaque identique à celui des PF a été réalisé pour les PUF mais en remplaçant les deux premières colonnes par les deux concentrations supplémentaires de PUF. Notons que la même procédure a été réalisée en exposant les cellules pendant 48 h aux extraits de filtre vierge ayant subi les mêmes traitements que les filtres retenant les PUF et qui ont servis comme blancs de filtre. Ces derniers seront notés par la suite « filtre blanc-aqueux, FB_aq » et « filtre blanc-organique, FB_org » correspondant respectivement aux filtres vierges ayant subi les mêmes protocoles de récupération de PUF dans l’eau et d’extraction des composés organiques au soxhlet, que ceux utilisés pour les échantillons composites de PUF-U et de PUF-R.

2.1.3. Tests de Cytotoxicité

La cytotoxicité des particules a été évaluée par deux méthodes colorimétriques complémentaires visant à étudier la perméabilité membranaire et l’activité métabolique mitochondriale.

2.1.3.a. Activité de la Lactate DésHydrogénase (LDH)

 Principe

C’est un test colorimétrique permettant la quantification de la lyse et de la mort cellulaire. Ce test est basé sur la mesure de l’activité de la LDH, une enzyme cytosolique stable, libérée du cytosol des cellules endommagées, dans le milieu de culture.

Dans une première étape, le Nicotineamide Adénine Dinucléotide (NAD⁺) est réduit en NADH/H⁺ par la conversion du lactate en pyruvate catalysée par la LDH libérée à partir des cellules. Ensuite durant la deuxième étape, l’enzyme diaphorase assure le transfert de deux atomes d’hydrogène à partir du NADH/H+

vers le sel de tétrazolium qui sera réduit en sel de formazan dont l’absorbance, mesurée par spectrophotométrie, est proportionnelle à la quantité de lactate déshydrogénase libérée (Figure II-13).

127 Figure II-13 : Principe du test de l’activité du lactate déshydrogénase.

 Protocole expérimental

100 µL/puit de surnageant des cellules ont été transférés dans une microplaque et incubés (à température ambiante et à l’abri de la lumière) avec le mélange réactionnel du kit « cytotoxicity detection kit (LDH) » (Roche Applied Science, Allemagne) en suivant les instructions du fabricant. L’absorbance du formazan formé a été mesurée par spectrophotométrie après 20 puis 30 min d’incubation à la longueur d’onde de 490 nm (longueur d’onde de référence = 630 nm) à l’aide d’un lecteur de microplaque (multiskan spectrum, Thermo Fisher Scientific, Saint Herblain, France). Une augmentation de l’absorbance du formazan reflète l’augmentation de l’activité de la LDH et par conséquent sa libération à partir des cellules, mettant en évidence la perturbation et/ou la perméabilité membranaire en présence du composé toxique étudié.

2.1.3.b. Activité de la DésHydrogénase mitochondriale (DHm)

 Principe

C’est un test colorimétrique permettant la quantification de la prolifération et de la viabilité cellulaire. Il est basé sur le clivage du sel de tétrazolium WST-1 (le 1,3-disulfonate de 4-[3-(4-iodophényle)-2-(4-nitrophényle)-2H-5-tétrazolio]-benzène) par la DHm dans les cellules vivantes. Le sel de tétrazolium sera transformé en formazan (rouge foncé) dont l’absorbance,

Lactate Pyruvate

LDH

NAD+ NADH + H+

Sel de tétrazolium (jaune pâle) Sel de formazan (rouge)

Etape 1

Etape 2

128 mesurée par spectrophotométrie, est proportionnelle à l’activité de la DHm et par conséquent à l’activité mitochondriale et la viabilité cellulaire.

 Protocole expérimental

L’activité enzymatique de la déshydrogénase mitochondriale a été déterminée dans les puits des microplaques contenant les cellules après avoir prélevé une partie du surnageant pour le test de la LDH. Le réactif WST-1 du kit (Roche Applied Science ; Allemagne) a été ajouté aux cellules puis incubé à 37 ºC à l’obscurité en suivant les instructions du fabricant. L’absorbance du formazan formé a été mesurée à l’aide d’un lecteur de microplaque après 2h, 2h30 et 3h d’incubation. Cette absorbance est proportionnelle à l’activité de la DHm dans les cellules vivantes.