Résultats I : Origine de l’hypoactivité du GPe dans la maladie de Parkinson
II. Origine du GABA responsable de l’inhibition tonique dans le GPe
1. Le GABA responsable de l’inhibition tonique
dans le GPe n’a pas une origine vésiculaire
Dans le but de discriminer la source de l’IT en conditions parkinsoniennes, nous avons émis l’hypothèse d’une augmentation de la libération de GABA dans l’espace extracellulaire. Cette libération peut être d’origine neuronale ou gliale. Nous avons donc tenté de discriminer les voies de libération de GABA dans le GPe. Apres avoir éliminé une augmentation de l’activité des axones striato-pallidaux comme source de libération de GABA responsable de l’IT (article 2, Fig. 2), nous avons bloqué toute libération vésiculaire de GABA d’origine neuronale (activité spontanée et miniature) et gliale avec la bafilomycine (4µM), un inhibiteur de l’ATPase de type vacuolaire (ATPase type V). En accord avec des études précédentes (Le Meur et al, 2012; Zhou et al, 2000 ), nous avons incubé les tranches pendant 1h30 dans une solution d’ACSF contenant 4µM de bafilomycine. Ce traitement entraîne une réduction très importante de la transmission synaptique GABAergique à la fois sur les tranches obtenues d’animaux contrôles et lésés à la 6-OHDA (Fig. 37A-C, G-I). Nous avons ensuite testé l’action de la GABAzine sur des neurones traités à la bafilomycine de rats témoins et lésés à la 6-OHDA. Chez les animaux témoins, le traitement à la bafilomycine a pour effet de faire apparaître un courant tonique (contrôle : I= 0; 0 -:8 pA (n=23) ; bafilomycine : I:
181
14,64; 9,8 - 26,8 pA (n= 12), p = 0,0018, Mann-Whitney test ; Fig. 37D-F). Chez les animaux 6-OHDA, la bafilomycine produit une augmentation significative de l’amplitude de l’inhibition tonique (6-OHDA : I= 15,50; 7 - 20 pA (n=8) ; bafilomycine I=70,80; 48,2 - 93,4 pA (n=7),
p = 0,0239, Mann-Whitney test ; Fig. 37J-L). Cette série d’expériences suggère que le GABA responsable de l’IT dans le GPe n’a pas une origine vésiculaire. De plus, nos résultats indiquent que bloquer les ATPase de type vacuolaire a pour effet d’augmenter l’amplitude de l’IT dans le GPe. A notre connaissance, il n’existe pas d’autres exemples dans la littérature d’un tel effet du blocage des ATPase vacuolaire sur l’IT.
Figure 37 : L’inhibition tonique pallidale n’a pas une origine vésiculaire.
A-B : Exemple de courants synaptiques enregistrés sur des tranches contrôles (A) ou incubées
pendant 1h30 dans une solution d’ACSF contenant 4µM de bafilomycine (B). C : Graphes montrant la réduction drastique de fréquence et d’amplitude des courants synaptiques spontanés en présence de bafilomycine.
D-E : Exemples d’enregistrements montrant l’effet de la GABAzine sur le courant de maintien des neurones du GPe. F : Boites à moustaches montrant la présence d’un courant tonique suite au traitement à la bafilomycine. G-L : Comme A-F, mais chez des rats 6-OHDA.* p<0.05, test de Mann-Whitney.
182
2. Les bestrophines ne sont pas responsables de la
libération gliale de GABA
Nous avons ensuite voulu tester, si comme dans le cervelet (Lee et al, 2010 ; Yoon et al, 2014), le GABA libéré par la glie pouvait avoir une origine non vésiculaire et être libéré par des canaux appelés Bestrophines 1 (BEST-1). Nous avons bloqué les canaux BEST-1 à l’aide du NPPB (50µM) appliqué directement dans le bain de perfusion. Alors que dans le cervelet le NPPB réduit de moitié l’amplitude de l’inhibition tonique, au niveau du GPe cet agent pharmacologique augmente de manière surprenante le courant tonique comparé à la situation contrôle (APV 50µM, DNQX 20µM et CGP55845 1µM) chez le groupe d’animaux témoins (contrôle : I= 0; 0 - 8 pA (n=23) ; NPPB : I: 111,08; 56,8 - 136,7 pA (n=5), p = 0,0003, test de Mann-Whitney test ; Fig. 38A-C). Chez les animaux 6-OHDA, le NPPB a tendance à également augmenter l’amplitude de l’IT mais de manière non significative (6-OHDA : I= 15,50; 7 - 20 pA (n=8) ; NPPB I=40,58; 9,8 - 81,8 pA (n=6), p = 0,219, test de Mann-Whitney test; Fig. 38B-C). Ces résultats suggèrent que, dans le GPe, le GABA n’est pas libéré par des canaux bestrophines situés sur les cellules gliales. L’augmentation de l’IT provoquée par le NPPB a aussi été montré dans le cervelet de façon inexpliquée (Diaz et al, 2012), il serait donc nécessaire d’utiliser d’autres agents connus comme inhibiteur de BEST-1 pour confirmer ce résultat.
Figure 38 : Les canaux bestrophines ne sont pas responsables de la libération gliale de GABA.
A-B : Tracés montrant l’effet de la GABAzine sur le courant de maintien des neurones du GPe en présence de NPPB (50µM), un antagoniste des canaux bestrophines. C : Boîtes à moustaches montrant une augmentation significative du courant tonique en présence de NPPB. *, p<0.05, test de Mann-Withney.
3. La voie des MAOB n’est pas impliquée dans la
synthèse de GABA d’origine gliale
Récemment une nouvelle voie de synthèse de GABA astrocytaire a été décrite dans l’hippocampe et le striatum (Jo et al, 2014 ; Yoon et al, 2014). Cette production de GABA par
183
la glie est dépendante de l’activité de la Monoamine oxydase de type B (MAOB). Dans le but de tester une production de GABA par la glie dépendante de cette voie de synthèse dans le GPe, nous avons incubé les tranches de cerveaux de rats 1h30-2h dans une solution d’ASCF contenant 100 nM de Séléginine, un inhibiteur de la MAOB, avant l’enregistrement des neurones du GPe. Ce traitement n’augmente pas significativement l’amplitude de l’IT chez les animaux témoins (Contrôle : I= 0; 0 -:8 pA (n=23) ; Séléginine : I=4,27; 0 - 26,2 pA (n=7) ; p = 0,329, test de Mann-Whitney ; Fig. 39A-B) tout comme chez les animaux 6-OHDA (6-6-OHDA : I= 15,50; 7 - 20 pA (n=8) ; Séléginine : I= 23,19; 12,8 - 43,9 pA (n=6), p = 0,332, Mann-Whitney ; Fig. 39C-D).
Figure 39 : La voie de la monoanimes oxydase B n’est pas impliquée dans la synthèse du GABA responsable de l’inhibition tonique pallidale.
A : Tracés montrant l’effet de la GABAzine sur le courant de maintien des neurones du GPe de tranches contrôles incubées pendant 1h30 à 2h dans 100 nM de ségélinine, un antagoniste de l’enzyme MAOB. B : Boîtes à moustaches montrant la présence d’un courant tonique malgré le blocage de la voie de synthèse gliale de GABA dépendante des MAOB.
C-D : Comme A-B mais sur des tranches issues de rats 6-OHDA
4. L’intégrité du métabolisme astrocytaire est
nécessaire à la régulation de l’inhibition tonique
dans le GPe
La densité astrocytaire dans le GPe est très élevée comparée aux autres noyaux des GB (Charron et al, 2014). De plus, il est connu depuis peu qu’il se produit une astrogliose caractérisée par une augmentation du nombre d’astrocytes ainsi que de leur surface dans le GPe en conditions parkinsoniennes chez plusieurs espèces animales comprenant le rat, le singe et l’homme (Charron et al, 2014). Ces données suggèrent une modification du fonctionnement astrocytaire dans le GPe dans la maladie de Parkinson.
Ainsi, nous avons voulu tester l’effet du blocage du métabolisme astrocytaire sur l’inhibition tonique pallidale. Pour cela, nous avons incubé pendant 1h les tranches de cerveaux dans une solution d’ACSF contenant 5 mM de fluoroacétate (FAC), un inhibiteur du cycle de krebs préférentiellement capté par les astrocytes en raison de sa ressemblance chimique avec l’acétate (Clarke et al, 1970 ; Lahiri & Quastel, 1963 ; Waniewski & Martin, 1998) puis enregistré les neurones du GPe en présence de 1mM de FAC dans le bain de perfusion.
184
Alors que chez les animaux témoins, le FAC ne modifie pas significativement l’amplitude du courant tonique présent en situation contrôle (contrôle : I= 0; 0 -:8 pA (n=23) ; FAC : I= 12,81; 0 - 14 pA (n=4); , p = 0.107, test de Mann-Whitney) (Fig. 40A-C), en situation de déplétion dopaminergique, le blocage du métabolisme astrocytaire augmente significativement l’amplitude du courant tonique (6-OHDA : I= 15,50; 7 - 20 pA (n=8) ; FAC : I= 55,84; 45,8 - 61,6 pA (n=4), p = 0,0084, Mann-Whitney) (Fig. 40D-F). Ces résultats suggèrent que chez les animaux lésés à la 6-OHDA, les astrocytes jouent un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie GABAergique.
Figure 40 : L’intégrité du métabolisme astrocytaire est nécessaire au contrôle efficace des concentrations de GABA extracellulaire et à la régulation du niveau d’inhibition tonique. A-B : Tracés montrant l’effet de la GABAzine sur le courant de maintien des neurones du GPe de tranches contrôle (A) et 6-OHDA (B) incubées pendant 1h30 dans 100 nM de ségélinine, un antagoniste de l’enzyme MAOB. C : Boîtes à moustaches montrant la présence d’un courant tonique malgré le blocage de la voie de synthèse gliale de GABA dépendante des MAOB. * p<0.05, test de Mann-Whitney.
Enfin, nous avons combiné l’inhibition du métabolisme astrocytaire avec le blocage pharmacologique des transporteurs GAT-1 et GAT-3. Nos résultats montrent que l’inhibition de GAT-1, mais pas de GAT-3, augmente significativement l’amplitude du courant tonique induit par le FAC seul chez les animaux témoins (FAC : I= 12,81; 0 - 14 pA (n=4), FAC +NNC : I= 104,37 ; 78,7 - 127,6 pA (n=4), FAC + SNAP : I= 23,19; 20,1- 25,6 pA (n=5) ; FAC vs FAC+NNC, p = 0,018, Kruskal-Wallis) (Fig. 41A-D). Concernant les animaux 6-OHDA, il n’y a aucune différence significative de courant tonique induit par le blocage des transporteurs GAT-1 ou GAT-3 suite au blocage du métabolisme astrocytaire (FAC : I= 55,84; 45,8 - 61,6 pA (n=4); FAC+NNC : I= 90,33; 55,5 - 166 pA (n=6) ; FAC+SNAP : I= 58,59; 53,1 - 81,2 pA (n=5), p = 0.56, Kruskal-Wallis) (Fig. 41D-F). Ces résultats suggèrent
185
que chez les animaux témoins, les niveaux extracellulaires de GABA dans le GPe sont principalement contrôlés par les transporteurs GAT-1 alors que chez les rats déplétés en dopamine, les astrocytes jouent un rôle primordial dans le maintien de l’homéostasie GABAergique.
Figure 41 : Le blocage du métabolisme astrocytaire associé au blocage des transporteurs augmente l’amplitude de l’inhibition tonique pallidale.
A-C : Tracés montrant l’effet de la GABAzine sur le courant de maintien des neurones du GPe de tranches incubées dans le FAC 1mM (A), incubées dans FAC puis perfusées avec du NNC711 (B) ou avec du SNAP5114 (C) pour bloquer respectivement les transporteurs GAT -1 ou GAT-3. D : Boîtes à moustaches résumant les effets de ces traitements pharmacologiques sur le courant tonique. E-H : Comme en A-D, mais sur des tranches de cerveaux de rats 6-OHDA. * p<0.05, test Kruskal-Wallis.