Optimisations des paramètres expérimentaux

Un des paramètres majeurs dans l’obtention d’un taux de recouvrement acceptable, est caractérisé par la quantité d’échantillon injectée. Ainsi la couverture de séquence du partenaire Hit1p est présentée pour 100 et 150 pmoles injectées (figure 25 et tableau 1).

Figure 25. Influence de la quantité de matériel injectée sur la couverture de séquence et la redondance peptidique obtenues pour Hit1p. Les peptides identifiés pour 100 pmoles de matériel injecté sont représentés en bleu, ceux pour 150 pmoles en rouge.

Tableau 1. Taux de couverture de séquence et indice de redondance associés à la figure 25.

Dans le cadre de cette protéine, une injection plus importante de matériel protéique permet d’augmenter la couverture de séquence de 8%, mais aussi d’améliorer l’indice de redondance de 1.9 à 3.2. Ce chevauchement accru au niveau peptidique se situe principalement dans la zone 24-56.

1.2. Influence du débit de passage sur la cartouche de digestion

Le débit de passage sur la cartouche de digestion est un paramètre qui doit faire l’objet d’une attention particulière. En effet le flux continu de solvant A (H2O, HCOOH 0.1%) entraine le matériel protéique de la boucle d’injection jusqu’à la pré-colonne de dessalage/concentration, en passant par la cartouche de digestion. Ce dernier est donc directement associé au temps de digestion, c’est-à-dire au temps où la protéine sera en contact avec l’enzyme immobilisée.

97 Avec le système utilisé au laboratoire, ce débit-là peut être modulé entre 0 et 200 µL/min. Dans le contexte de l’étude du complexe ternaire Snu13p/Rsa1p/Hit1p, trois débits ont été testés : 75, 100 et 150 µL/min correspondant respectivement à une durée de contact avec l’enzyme d’environ 34, 30 et 22 secondes. De façon intuitive, nous aurions tendance à penser que plus le temps de digestion est élevé, meilleure la couverture de séquence sera. Cette idée n’est pas toujours vraie, comme le montrent les résultats obtenus pour Hit1p (figure 26 et tableau 2).

Figure 26. Influence du débit de passage à travers la cartouche de digestion sur la couverture de séquence et la redondance peptidique obtenues pour Hit1p. Les peptides identifiés pour un débit de 75 µL/min sont représentés en bleu, 100 µL/min en rouge et 150 µL/min en vert.

Tableau 2. Taux de couverture de séquence et indice de redondance associés à la figure 26.

En effet la couverture de séquence obtenue pour un débit de 75 µL/min demeure inférieure de 5 et 8% à celles obtenues pour des débits de 150 et 100 µL/min. Toutefois nous pouvons observer que le débit intermédiaire présente la meilleure couverture de séquence (97% vs. 94%) et un indice de redondance supérieur (3.2 vs. 2.0) par rapport au débit le plus rapide. Un autre paramètre peut être ajusté au niveau de la cartouche de digestion, c’est la régulation de la température de l’enceinte dans laquelle elle se trouve. Dans le cadre de ces travaux, nous n’avons pas modifié la température de digestion, et avons choisi de travail à une valeur de 20°C. Deux raisons ont dicté ce choix :

- premièrement nous avons souhaité favoriser l’efficacité de digestion. En effet, l’activité enzymatique est plus importante à cette température, qu’à 0°C [122, 123].

98 - deuxièmement, le temps de passage sur la cartouche de digestion est relativement rapide (généralement entre 15 et 30 secondes). Ainsi le phénomène de ré-échange est assez limité. Cet aspect est plus problématique avec une digestion en solution, nécessitant généralement quelques minutes. De plus, nos études se sont basées sur des approches comparatives et non absolues, ceci conférant une « tolérance » plus importante à l’éventuel ré-échange.

1.3. Influence d’agents chaotropiques et/ou réducteurs

L’ajout d’agents dénaturants et/ou réducteurs peut permettre d’améliorer l’accessibilité de la protéine à l’enzyme et ainsi d’accroitre l’efficacité de digestion [15, 44, 45, 122]. Dans le cadre de nos expériences, nous avons évalué l’effet de la concentration en agent réducteur pour des protéines présentant des ponts disulfures, comme l’allergène Artv3 (figure 27 et tableau 3).

Figure 27. Influence de la concentration en agent réducteur (TCEP) sur la couverture de séquence obtenue pour Artv3. Les peptides identifiés pour le tampon de « quench » guanidine 2M TCEP 100mM et guanidine 2M TCEP 200mM sont respectivement représentés en bleu et rouge.

Tableau 3. Taux de couverture de séquence associé à la figure 27.

Ainsi le fait de passer de 100 à 200 mM en TCEP permet de gagner 27% en couverture de séquence pour cette protéine. Le taux de recouvrement n’est certes pas optimal (60%), toutefois cette comparaison montre l’intérêt à optimiser ce paramètre.

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1.4. Influence du temps de « quench »

Le temps de « quench » peut aussi être optimisé de manière à améliorer la couverture de séquence ou l’indice de redondance. En effet, certaines protéines peuvent être très structurées avec notamment la présence de ponts disulfures. Ainsi le temps de « quench » est directement lié au temps alloué à la réduction et dénaturation de la protéine. De façon générale nous avons fixé ce temps à 30 secondes, toutefois dans certains cas, une durée allongée permet d’augmenter le taux de recouvrement. Ainsi pour l’étude de l’allergène Artv3, le fait de passer de 30 à 120 secondes de temps de « quench » et donc de réduction/dénaturation, nous permet d’observer un très léger gain de couverture de séquence (de 60% à 62%) mais une nette amélioration au niveau de l’indice de redondance (1.8 vs. 2.5) (figure 28 et tableau 4).

Figure 28. Influence du temps de « quench » sur la couverture de séquence et la redondance peptidique obtenues pour Artv3. Les peptides identifiés pour un temps de 30 et 120 secondes sont respectivement représentés en bleu et rouge.

Tableau 4. Taux de couverture de séquence et indice de redondance associés à la figure 28.

Toutefois, l’augmentation du temps de « quench » introduit une durée supplémentaire entre le marquage et l’analyse de l’échantillon, ce qui contribue a fortiori à l’augmentation du ré-échange. Il est donc important de trouver le bon équilibre entre les effets positifs de l’allongement de la durée de « quench » (recouvrement et/ou indice de redondance), et ses effets négatifs comme l’augmentation du ré-échange. De plus, la couverture de séquence obtenue pour cette protéine demeure largement insatisfaisante. Malgré l’ajout de fortes concentrations en TCEP (jusqu’à 500 mM), cette dernière ne s’en trouve pas améliorée. La présence de 4 ponts disulfures confère ici à l’allergène un caractère récalcitrant vis-à-vis de la digestion ; la réduction électrochimique pourrait être ici une alternative intéressante [48].

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1.5. Influence de l’enzyme

Très récemment, nous avons eu la possibilité d’acquérir un cartouche de digestion avec une autre enzyme immobilisée que la pepsine : la népenthésine [39]. Nous avons alors testé son efficacité sur le complexe ternaire Snu13p/Rsa1p/Hit1p. Si l’utilisation de cette enzyme génère des taux de recouvrement inférieurs à la pepsine pour les partenaires Snu13p et Rsa1p, elle présente un intérêt pour le partenaire Hit1p (figure 29 et tableau 5).

Figure 29. Influence de la nature de l’enzyme de digestion sur la couverture de séquence et la redondance peptidique obtenues pour Hit1p. Les peptides issus de la digestion sur cartouche de pepsine sont représentés en bleu, ceux issus de la digestion sur cartouche de népenthésine sont identifiés en rouge.

Tableau 5. Taux de couverture de séquence et indice de redondance associés à la figure 29.

La couverture de séquence issue de la digestion à la népenthésine est légèrement inférieure à celle issue de la pepsine (92% vs. 94%). Cependant elle présente un indice de redondance légèrement supérieur (2.0 vs. 1.6), et une complémentarité au niveau de la redondance peptidique. En effet, au niveau N-ter de la protéine nous pouvons observer 3 peptides se superposant, ce qui pourrait permettre d’augmenter la résolution spatiale si des changements se produisaient dans cette zone après deutération. C’est aussi le cas de la région 60-78 qui présente qui présente des peptides chevauchants complémentaires.

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