Chapitre 1 : Caractérisation d’ADCs par MS native haute résolution
2. De la MS native classique vers la haute résolution
Afin de saisir l’importance des paramètres instrumentaux associés aux deux spectromètres de masses qui seront ici comparés, le Synapt G2 HDMS et l’Exactive Plus EMR, une description approfondie du fonctionnement de ces derniers est réalisée au sein de ce paragraphe.
2.1. Présentation du Q-TOF Synapt G2 HDMS (Waters) en mode MS native
La description détaillée de l’instrument a été faite dans la partie 2, toutefois nous allons ici présenter les spécificités de cet instrument en mode MS native (figure 10) :
ð les ions sont ici générés à l’aide d’un automate d’infusion nanoESI (Triversa Nanomate, Advion) par application d’une différence de potentiel entre la puce microfluidique et le cône d’échantillonnage puis le cône d’extraction du bloc source. Le cône conducteur contenant l’échantillon vient se juxtaposer sur une position particulière de la puce microfluidique.
ð la pression résiduelle au sein du bloc source peut être contrôlée grâce à une vanne de fuite dans le système de pompage primaire (2-8 mbar) [48]. En effet, la dégradation du vide à ce niveau, permet de contrôler l’accélération des ions entre deux chocs consécutifs et ainsi de maintenir des assemblages non-covalents.
ð l’optimisation des énergies de collision des cellules Trap et Transfer CE permet de donner suffisamment d’énergie interne aux ions pour les transmettre jusqu’à l’analyseur sans toutefois rompre les complexes, avec une pression résiduelle en argon de 10-2 mbar. La cellule IM, où règne une pression résiduelle en argon de 10-4 mbar est ici utilisée comme guide d’ion.
ð comme décrit précédemment, l’analyseur TOF peut ici être utilisé sous différents modes (sensibilité, résolution ou haute résolution). Les prérequis de la MS native privilégieront le mode résolution pour des complexes de taille relativement restreints (≤ 30kDa) et le mode sensibilité pour des plus hauts poids moléculaires.
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Figure 10. Représentation schématique du Synapt G2 HDMS (Waters), adaptée de [49]
2.2. Présentation de l’Orbitrap Exactive Plus EMR (ThermoFischer Scientific)
L’Orbitrap Exactive Plus EMR est un spectromètre de masse à analyseur Orbitrap conçu pour l’analyse de complexes non-covalents de hauts poids moléculaires. Cet instrument (figure 11) basé sur la géométrie d’un Orbitrap Exactive Plus a subi quelques modifications de manière à s’adapter aux contraintes de la MS native [38, 39] :
- une extension de la gamme d’analyse à 20000 Th, de part la modification du logiciel de pilotage (« Extended Mass Range », EMR).
- une augmentation des potentiels radiofréquences (RF) est appliquée à l’ensemble des multipôles, afin de favoriser la transmission des ions de plus hauts rapports m/z. - une augmentation des énergies de collision ainsi que le contrôle de la pression en gaz
au sein de la cellule HCD, de manière à mieux thermaliser, focaliser et désolvater les ions.
- un contrôle direct des paramètres de transmission (flatapôles) pour une meilleure sensibilité en fonction des rapports m/z des ions générés.
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Figure 11. Représentation schématique de l’Orbitrap Exactive Plus EMR couplé à un robot d’infusion Nanomate (Advion).
Les pressions au sein de l’appareil sont régulées à l’aide d’une pompe primaire et de deux pompes turbomoléculaires. Ce spectromètre de masse se subdivise en 5 parties distinctes :
ð l’interface bloc source, constitué principalement d’un capillaire de transfert en métal (point d’entrée des ions) connecté à une série de lentilles annulaires « S-lens ». Les ions générés en amont du capillaire de transfert (automate d’infusion nanoESI) sont aspirés par un gradient de pression décroissant, et sont transmis jusqu’aux lentilles « S-lens ». Ces dernières sont utilisées comme un dispositif de transmission des ions. Les ions de rapports m/z de plus en plus élevés sont transmis progressivement de part l’application d’une tension radiofréquence (RF) d’amplitude croissante et en opposition de phase sur les lentilles « S-lens » [50]. Au sein de cette interface, la pression ne peut être régulée (elle reste constante ≈ 2 mbar), toutefois le contrôle de la différence de potentiel entre les « S-lens » et la lentille « Exit S-lens » relative à l’énergie de collision en source (CID) permet de maitriser l’accélération des ions et ainsi de préserver l’intégrité d’édifices non-covalents.
ð un bloc optique de transmission, composé des flatapôles « injection », « inter »,
« bent » et d’un octopôle de transfert. Cette série d’optiques focalise et transmet les
143 barreaux plats soumis à une tension radiofréquence, permettant ainsi de focaliser les ions. La transmission des ions depuis le bloc « S-lens » se fait au travers de l’application d’un potentiel continu DC sur « l’injection » flatapôle. De la même manière, les ions sont transférés jusqu’à « l’inter » flatapôle, ce dernier pouvant être apparenté à une lentille annulaire plate. Le « bent » flatapôle, constitué de quatre barreaux plats, permet quant à lui de focaliser et transmettre les ions jusqu’à l’octopôle de transfert. Sa particularité vient de son orientation à 90° favorisant ainsi l’élimination d’espèces neutres et de gouttelettes résiduelles de solvant. Là aussi des potentiels RF permettent de drainer les ions, alors que l’application d’un potentiel DC permet d’éjecter les ions vers le multipôle de transfert. Ce dernier opère seulement en mode radiofréquence (« RF-only ») et permet d’acheminer les ions à la C-Trap, avec une pression comprise entre 10-4 et 10-5 mbar selon la pression délivrée dans la cellule HCD [38].
ð la trappe linéaire incurvée « C-Trap » et la cellule de collision « HCD » (High energy Collision Dissociation) sont deux parties distinctes mais opèrent de façon synchronisée. Elles permettent tour à tour de piéger, thermaliser et parachever la désolvatation des ions [39]. L’approvisionnement en gaz de la C-trap permet de thermaliser les ions au travers de collisions permettant de dissiper leur énergie cinétique, alors que l’application d’un potentiel RF permet de les concentrer en son centre. Les ions sont ensuite éjectés vers la cellule HCD par application d’un potentiel DC, où sera poursuivi leur désolvatation au travers de collisions avec un gaz neutre (azote, xénon). L’optimisation du gradient de potentiel au sein de la cellule HCD (énergie de collision HCD ou CE) permet de contrôler l’accélération des ions entre deux chocs consécutifs. Si la modulation de la pression en gaz se fait à travers une vanne située dans la cellule HCD, la pression y régnant ne peut y être directement déterminée, toutefois la pression mesurée au sein de l’analyseur orbitrap y est indirectement associée (10-9 à 10-10 mbar). Une inversion du potentiel DC permet ensuite de rediriger les ions vers la C-Trap, où ils pourront ensuite être extraits vers l’analyseur orbitrap.
ð la cellule orbitrap combine le rôle d’analyseur mais aussi de détecteur. Elle est constituée d’une électrode centrale de forme fuselée, cette dernière étant entourée d’électrodes externes ayant ce rôle de détection des ions [51, 52] (figure 12).
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Figure 12. Représentation schématique de la cellule orbitrap (adaptée à partir de [53]). Les ions représentés en rouge tournent autour de l’électrode centrale (a) tout en se déplaçant le long de l’axe z, de part l’application d’un champ électrique entre l’électrode centrale fuselée et les électrodes externes (b). Ces dernières sont isolées par une gaine en céramique (c).
L’application d’un champ électrique au niveau de l’électrode centrale permet l’injection des ions au sein de l’analyseur. L’attraction du nuage d’ions vers l’électrode centrale est alors compensée par leur propre force centrifuge, leur permettant d’adopter une trajectoire oscillatoire suivant l’axe de l’électrode. L’oscillation harmonique de ce nuage d’ions se traduit par la production d’un courant global induit, pouvant être mesuré par les électrodes externes. Le traitement de ce signal par Transformée de Fourrier permet des caractériser les fréquences ω et amplitudes propres à chaque ion qui dépendent directement de leur rapport m/z et de leur intensité (équation 1) [54] :
(1) ÷ ø ö ç è æ
=
z
m
k
z 1/
w
,où k est une constante relative à la courbure du champ électrique de l’instrument.
La fréquence d’oscillation ω est d’autant plus importante que le rapport m/z est faible, ainsi pour les ions de hauts rapports m/z, une accumulation du signal plus importante sera nécessaire. La résolution de cet analyseur étant directement reliée au nombre de mesures de ω par temps de scan, elle diminue d’autant plus que le rapport m /z est élevé. La particularité de ce type d’instrument est de pouvoir choisir le temps de scan (32, 64, 128, 256 ou 512 ms) associé à une résolution instrumentale (respectivement 8750, 17500, 35000, 70000 et 140000 à m/z 200). Toutefois il est possible de calculer
145 la résolution instrumentale théorique pour un rapport m/z donné à partir de l’équation (2) : (2)
z
m
nom
R
R
/
200
´
=
,où Rnom correspond à la résolution nominale de l’instrument fixée à m/z 200.