Optimisation des vecteurs d’expression et du protocole de surexpression en levure

i. Clonage du gène entier des HsTop2 dans le vecteur d’expression pYES2.1

Les gènes des deux isoformes ont été clonés dans des vecteurs d’expression issus de la combinaison de plusieurs plasmides (ci-dessus paragraphe 1) qui nous ont été gracieusement fournis par Caroline Austin (Institute for Cell and Molecular Biosciences, The

Medical School University of Newcastle, UK) (Austin et al., 1995; Worland and Wang, 1989). Les isoformes avec lesquels nous travaillons sont des chimères entre les Top2 humaines et la Top2 de levure S.cerevisiae (ScTop2). Pour des raisons de compatibilité des sites d’enzymes de restriction, lors de la construction de ces plasmides, les 5 premiers codons de ScTop2 ont été fusionnés au 28ème codon du gène de l’isoforme et au 46ème codon du gène de l’isoforme !. Il a été montré que malgré les extrémités N-terminales tronquées, les enzymes recombinantes conservent leurs activités in vivo et in vitro (Austin et al., 1995; Wasserman et al., 1993). Avant mon arrivée dans le laboratoire, une étiquette 10 histidines précédées du site de coupure de la PPX (PreScission protease) a été ajoutée aux constructions en C-terminal des enzymes produites (Figure 20). L’expérience du laboratoire sur les protéines de grandes tailles nous a montré qu’une étiquette de 10 histidines

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permettrait une rétention plus efficace des protéines sur la colonne d’affinité au nickel, lors de la purification.

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Figure 20 Construction des gènes chimères des isoformes des Hstop2 avec les éléments de régulation a. Construction d’origine de l’isoforme par Wassermann et al. en 1993 et l’isoforme ! par Austin et al. en 1995. b. Ajout des étiquettes 10 histidines précédées par un site de coupure à la PPX (PreScission protease) sur les constructions d’origines. c. Transfert des constructions intactes dans le plasmide pYES2.1

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Figure 21 Plasmides d’expression des isoformes de HsTop2 dans S.cerevisiae, construites par l’équipe. En bleu l’étiquette polyhistidines ajoutée en C-terminal de l’enzyme. En vert les éléments du plasmide pYES2.1 (Invitrogen).

75 Afin de s’émanciper des origines multiples des plasmides et de faciliter les clonages de ces gènes à l’avenir, nous avons introduit les gènes entiers dans le vecteur pYES2.1 (Invitrogen™) spécialement conçu pour faciliter l’insertion de gène (Ligation Topo TA) et la surexpression des protéines recombinantes dans la levure (promoteur pGAL1) (Figure 21). Nous avons conservé les constructions originales des gènes avec les 5 premiers codons de ScTop2, le site de coupure à la PPX et l’étiquette 10 histidines en C-terminal. Les gènes ont été amplifiés par PCR avec des extrémités franches, aucun site de restriction n’a été introduit car la méthode Topo TA s’affranchit des étapes de restriction/ligation classiques (Zhou and Gomez-Sanchez, 2000). Aux produits PCR ont été ajoutées des adénines aux extrémités 3’ par incubation avec de la Taq polymérase (matériels et méthodes). L’amplification a été réalisée de sorte que la complémentation des extrémités A en 3’ cohésives du produit PCR avec l’extrémité T en 5’ sortante du plasmide linéarisé permette la reconstruction du codon « start » du gène. Le codon stop a été conservé après l’étiquette 10 histidines (Figure 22).

Figure 22 Carte du plasmide pYES2.1-HsTop2. Les éléments spécifiques aux levures : 2µ ori est l’origine de réplication des plasmides de levures (rouge). Le gène URA3 est un marqueur de sélection d’auxotrophie pour l’uracile (vert), le promoteur GAL1 est inductible au galactose (gris). Les éléments bactériens : ori, l’origine de réplication bactérienne pour son amplification (orange), AmpR le gène de résistance à l’ampicilline (violet).

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ii. Optimisation du protocole de culture

Les transformations des plasmides dans les cellules S.cerevisiae ont été réalisées par choc thermique avec la méthode LiAc/ssDNA carrier/PEG (Matériels et Méthodes). Dans un premier temps, comme décrit dans les articles de références (Austin et al., 1995; Worland and Wang, 1989), le plasmide pTRX-hTOP2! (isoforme !) a été transformé dans la souche Jel1#Top1 (Knab et al., 1993; Lindsley and Wang, 1991) et le plasmide YepWOB6 (isoforme ) dans la souche BCY123. Les deux souches sont déficientes en protéases et auxotrophes pour l’uracile (ura3). Par la suite, nous avons utilisé la souche Jel1#Top1 pour les deux isoformes car BCY123, s’est révélée moins efficace lors de la surexpression.

La souche Jel1#Top1, dérivée de la souche JEL1, est déficiente en Top1 ce qui ralentit sa croissance (temps de génération de 90 minutes au lieu de 40 minutes). Elle a été utilisée dans des études de mutants des Top1 et l’étude de la camptothécine, un inhibiteur des Top1 (Knab et al., 1993). Les cellules transformées sont mises en culture dans un milieu minimum sans uracile contenant 2% de glucose, 2% de glycérol et 2% d’acide lactique. En phase de croissance logarithmique tardive environ 24h après l’inoculation, l’ajout de 2% de galactose Figure 23 Régulation de l’expression des gènes par le promoteur pGAL. Les protéines Gal4 et Gal80 sont des protéines de régulation. Gal4 est un activateur et Gal80 un inhibiteur de la transcription. a. Dans un milieu sans galactose et avec glucose la protéine Gal4 est inhibée par interaction avec le répresseur Gal80 b. En présence de galactose la protéine Gal80 est inhibée par interaction avec Gal3 (non représentée sur le schéma). La protéine Gal4 active la transcription par le recrutement de co-activateurs et de facteurs généraux de la machinerie de transcription (SAGA, TBP, Pol II).

77 dans le milieu de culture va induire l’expression du gène sous la dépendance de pGAL1 (Figure 23) (Austin et al., 1995; Wasserman et al., 1993). Ce protocole nécessite deux étapes de préculture de 24h avant l’inoculation et il s’étale sur 8 jours. Au moment de changer de vecteur d’expression, nous avons modifié le protocole de surexpression. Nous avons créé un protocole de 5 jours avec une seule préculture qui est réalisée dans un milieu minimum sans uracile contenant 2% de glucose jusqu'à ce que les cellules soient en phase logarithmique tardive favorable à l’induction. Puis elles sont inoculées et la surexpression est induite au même moment dans un milieu de croissance minimum sans uracile contenant 2% de raffinose et 2% de galactose. Le temps d’induction a été allongé de 16 à 24 heures sans impacter la qualité des enzymes produites (Figure 24). Les gels d’induction montrent un enrichissement protéique équivalent pour les deux protocoles et les deux vecteurs d’expressions (Figure 24).

Figure 24 Gel d’induction de l’isoforme produite à partir des plasmides pWOB6 (milieu Acide lactique / Glycérol) et pYES2.1 (milieu Raffinose). ni = cellules non induites, i= cellules induites. Le léger décalage des poids moléculaires élevés vers le haut, par rapport au marqueur de poids moléculaire, peut être imputé au dépôt d’extraits totaux, très riche en protéines et acides nucléiques.

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Figure 25 Optimisation du protocole de production des isoformes de HsTop2. À gauche la culture sur 7 jours dans un milieu Acide lactique/Glycérol. L’induction est déclenchée le 6ème jour après 24 heures de culture. À droite le protocole de culture optimisé en milieu raffinose, les étapes d’inoculation et d’induction se font au même moment le 5^ème jour.

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4. Expression des isoformes dans les cellules BHK21