Les modifications et régulation des Top2

5. Les modifications et régulation des Top2

Les Top2 eucaryotes sont soumises à de nombreuses modifications post-traductionnelles (MPTs) qui influencent leur localisation et leurs activités catalytiques à différents moments du cycle cellulaire. À l’heure actuelle trois types de modifications ont été observés : les phosphorylations (Isaacs et al., 1998), les sumoylations (Azuma et al., 2005; Bachant et al., 2002; Dawlaty et al., 2008; Diaz-Martinez et al., 2006; Nitiss, 2009a; Ryu et al., 2010; Wong et al., 2004) et les ubiquitinations (Mao et al., 2001).

i. Les phosphorylations

La découverte du rôle physiologique de la phosphorylation date des travaux d’Eddie Fischer et Ed Krebbs en 1955, puis de la découverte de la protéine kinase A (PKA) en 1968. Les phosphorylations ont un rôle majeur dans la régulation de la fonction des protéines dans la cellule. Chez l’homme, La sérine, la thréonine et la tyrosine sont phosphorylées avec une proportion de 86%, 12% et 2% (Johnson, 2009). En 2002 la publication du « kinome » humain a permis l’identification de 518 protéines kinases au total. Des études phylogénétiques ont mis en évidence que la majorité des familles de kinases sont partagées parmi les eucaryotes (Johnson, 2009).

La réaction de phosphorylation est toujours réalisée de la façon suivante :une protéine kinase catalyse le transfert du phosphate " (PO43-) d’un ATP sur une sérine, une thréonine ou une tyrosine. La réaction inverse est catalysée par les protéines phosphatases. Lié de manière covalente au résidu, le groupement phosphate possède à pH physiologique une double charge négative (pI : ~6,7) et deux atomes d’oxygène capables de former des liaisons hydrogènes avec les groupements chargés des résidus à proximité. Aucune chaîne latérale ne possède ces caractéristiques physico-chimiques. Plusieurs types d’interactions peuvent être observés. Le groupement phosphate interagit fréquemment avec les groupements guanidiniums des chaînes latérales d’arginine induisant une stabilisation d’un état conformationel particulier. Une interaction avec l’extrémité libre NH+ de la chaine principale des hélices peut également être observées, ainsi qu’une interaction avec les acides aminés polaires. Cette modification locale peut induire des modifications structurales drastiques telles que l’activation ou l’inhibition enzymatique mais également la création d’interface de reconnaissance pour des partenaires protéiques (Johnson, 2009). Les phosphorylations jouent un rôle majeur dans la cellule. Elles régulent l’activité de nombreuses enzymes par activation/inactivation. Elles sont impliquées à de nombreux niveaux cellulaires.

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La phosphorylation des ADN topoisomérases a été reportée pour la première fois dans les années 1980 après identification d’une topo I qui fut à l’origine purifiée comme une phosphoprotéine nucléaire à partir de cellules d’hépatome humain (Durban et al., 1983). En 1984, Sander et al. ont mis en évidence l’association d’une protéine kinase avec la Top2 de

Drosophila melanogaster (Sander et al., 1984). Les études in vitro menées dans le but de comprendre le rôle des phosphorylations sur l’activité enzymatique des Top2 ont donné lieu à des résultats contradictoires. En effet, la phosphorylation in vitro de la Top2 de drosophile par la caséine kinase et la protéine kinase C résulte en une augmentation de l’activité enzymatique ; le même résultat a été observé sur ScTop2 (Ackerman et al., 1985; Cardenas et al., 1992; Cardenas and Gasser, 1993). Une expérience équivalente réalisée sur les cellules HL60, a entraîné une diminution de l’activité enzymatique (Constantinou et al., 1989). Deux études ont montré que l’augmentation de l’activité des Top2 phosphorylées pourrait être liée à l’augmentation de l’hydrolyse d’ATP et l’augmentation de l’affinité pour l’ADN (Corbett et al., 1992; Dang et al., 1994). L’hypothèse selon laquelle la phosphorylation du domaine C-terminal servirait à annuler son rôle de régulateur négatif de l’activité de l’enzyme a également été envisagée (Cardenas and Gasser, 1993).

Les Top2 eucaryotes sont phosphorylées in vivo et en fonction du cycle cellulaire avec une augmentation en G2/M (Cardenas et al., 1992; Heck et al., 1989). En 1994 et 1995 Wells et al. (Wells et al., 1994; Wells et al., 1995; Wells and Hickson, 1995) furent les premiers à cartographier les sites de phosphorylations sur l’isoforme humain et observer les variations de phosphorylation de chaque site en fonction du cycle cellulaire. Les deux isoformes humaines sont phosphorylées in vivo mais les modifications spécifiques à l’isoforme ! sont encore mal connues (Burden and Sullivan, 1994; Kimura et al., 1994). Plusieurs types de kinases ont été identifiés comme responsables de la catalyse des phosphorylations sur l’isoforme : la Caséine kinase II (CKII) (Isaacs et al., 1998)., Caséine kinase 1 (Grozav et al., 2009), proline directed kinase (Wells and Hickson, 1995), polo like kinase 1 (Iida et al., 2008; Li et al., 2008), p34cdc2,MAP (mitogen-activated protein kinase), protéine kinase C (Wells et al., 1995). De plus certaines études suggèrent que la régulation de l’activité des HsTop2 via leur degré de phosphorylation au cours du cycle cellulaire pourrait influencer leur sensibilité aux molécules inhibitrices utilisées en chimiothérapie des cancers (Aoyama et al., 1998; Ganapathi et al., 1996). Takano et al. ont observé une hyperphosphorylation de l’isoforme dans une lignée de cellules résistantes à l’étoposide (Takano et al., 1991). d’autres études ont relevé une corrélation entre l’hypophosphorylation de l’isoforme et la résistance aux inhibiteurs Doxorubicine, étoposide et m-AMSA ((Ganapathi et al., 1996; Ritke et al., 1995; Wells and Hickson, 1995).

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ii. Les acétylations

Les acétylations sont des modifications de première importance dans la cellule. Les HDAC (Histone déacétylase) ont été très largement étudiées car elles régulent l’accessibilité de l’ADN pour la machinerie transcriptionnelle par la modification des queues d’histones.

En 2000 Tsai et al. on montré que les deux isoformes de Top2 interagissent in vivo avec les HDACs dans une région conservée dans toute la famille (Tsai et al., 2000). Comme le suggèrent les auteurs, cette interaction pourrait appartenir à un complexe d’activité de remodelage de l’ADN. Il reste encore à établir si les HsTop2 sont acétylées in vivo. À l’heure actuelle, même si quelques acétylations ont été découvertes lors de l’analyse de protéome sur lignée cellulaire (PhosphoSite plus), aucune information in vivo ou in vitro n’est disponible sur l’état d’acétylation des Top2 humaines. De manière générale la réaction d’acétylation est réalisée par le transfert d’un groupement acétyle (CH3CO) à partir d’une Acétyle Coenzyme A vers sur une lysine. Cette réaction est catalysée par une lysine transférase (KAT) dont les plus connues sont les HAT (Histone Acétyle Transférase). Le groupement acétyle neutralise la charge positive du résidu. Comme pour les phosphorylations, le changement de charge locale induit des remaniements structuraux sur la protéine entière.

iii. Les sumoylations

Les sumoylations ont été découvertes fin des années 1990 par les groupes de Günter Blobel et Frauke Melchior (Hay, 2005). Cette modification post-traductionnelle aboutit à la fixation covalente d’une ou plusieurs protéines SUMO (Small Ubiquitine like MOdifier) sur un résidu lysine accepteur de la protéine ciblée. Cette modification permet la régulation des fonctions cellulaires des protéines cibles, telles que le trafic intracellulaire, l’interaction avec des partenaires cellulaires (Hay, 2005).

En 2002, Bachant et al. ont montré que la Top2 de S.cerevisiae est régulée par la protéine SUMO. La mutation de SMT4, une isopeptidase qui intervient dans la maturation de SUMO, conduit à la séparation précoce des chromatides sœurs lors de la métaphase et avec un défaut de cohésion spécifique des régions proches du centromère (Bachant et al., 2002). Ce défaut est compensé par une surexpression de Top2 ou par la mutation de tous les sites potentiellement modifiés par SUMO. Il est possible que la sumoylation des Top2 limite leur capacité à participer au maintien de la cohésion des chromosomes et que cette modification inhibe leur capacité de décaténation. Il est connu que les Top2 interviennent dans la maintenance de la structure des chromosomes, la sumoylation peut donc avoir un

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impact important sur cette structure. Les sumoylations des isoformes des Top2 sont très importantes dans les cellules mammifères. Des expériences dans Xenopus laevis ont montré que PIAS", une SUMO E3 ligase, joue un rôle dans la séparation des chromosomes et dans la sumoylation des protéines situées au niveau du centromère notamment la Top2 qui en plus aurait un défaut de localisation si elle n’est pas sumoylée (Azuma et al., 2005; Diaz-Martinez et al., 2006). Cependant ces résultats n’ont pas été confirmés chez la souris (Roth et al., 2004; Wong et al., 2004). Des études récentes ont contribué au questionnement du rôle de PIAS" dans la sumoylation des Top2.

RANBP2 est une nucléoporine qui possède une activité SUMO E3 ligase, c’est un gène essentiel dans la souris dont la sous expression entraîne un défaut de ségrégation, la constitution de structures anormales lors de l’anaphase et un degré élevé d’aneuploïdie (Dawlaty et al., 2008). Des analyses in vitro ont montré que la « sous » expression de RANBP2 entraînait un défaut de sumoylation des Top2 et un défaut de localisation au niveau du centromère. Cet effet est compensé lorsque des Top2 sumoylées ou RANBP2 sont ajoutées au système. Dawlaty et al. ont également montré que ce résultat n’est pas transposable chez la souris. RANBP2 serait donc la principale SUMO de Top2 chez l’homme. Les résultats observés chez Xenopus leavis pourrait indiquer que d’autres protéines sumoylées par PIAS" sont essentielles à la bonne ségrégation des chromosomes. Les observations faites via RANBP2 montrent que les Top2 sont essentielles à la stabilité des chromosomes.

55 Tableau 2 Liste des partenaires protéiques des HsTop2 répertoriés dans la littérature. APC, adenomatous polyposis coli; CAPH, condensin complex subunit 2; CDC2, cell division cycle 2; CHRAC1, chromatin accessibility complex protein 1; CK2, casein kinase II; CRM1, chromosome region maintenance 1; HDAC, histone deacetylase; MDC1, mediator of DNA damage checkpoint 1; PARP, poly(ADP-ribose) polymerase 1; PCNA, proliferating cell nuclear antigen; RANBP2, RAN-binding protein 2; RAR , retinoic acid receptor- ; TOPBP1, topoisomerase binding protein 1.

Isoformes Partenaires Rôles cellulaires ^Réf.

Top2

D.melanogaster ^{CHRAC1 Complexe de remodellage de la chromatine}

(Varga-Weisz et al., 1997) Top2 PCNA Réplication de l'ADN ^{(Niimi et al.,} ₂₀₀₁₎ Top2 RanBP2 SUMO E3 ligase ^{(Dawlaty et al.,} ₂₀₀₈₎ Top2 PIAS SUMO E3 ligase ^{(Ryu et al.,} ₂₀₁₀₎ Top2 Polo-like kinase (PLK) Phosphorylation ^{(Li et al., 2008)} Top2 Aurora B Kinase Phosphorylation ^{(Coelho et al.,} ₂₀₀₈₎ Top2 HMGB1 Chaperonne des Top2 sur certaines structures d'ADN ^{(Stros et al.,} ₂₀₀₇₎ Top2 14-3-3-e Modulation de l'activité ^{(Kurz et al.,} ₂₀₀₀₎ Top2 APC Régulation des protéines mitotiques ^{(Wang et al.,} ₂₀₀₈₎ Top2 BRCA1 Activation de la décaténation ^{(Lou et al.,} ₂₀₀₅₎ Top2 CAPH Nécessaire pour la séparation des chromatides sœurs ^{(Bhat et al.,} ₁₉₉₆₎ Top2 CDC2 Protéine kinase qui régulera progression du cycle cellulaire ^{(Wells and} _{Hickson, 1995)} Top2 CRM1 Protéine d'export nucléaire, élimine les Top2 du noyau. ^{(Mirski et al.,} 2007; Turner et

al., 2004) Top2 Jab1 ou CSN5 Régulation de la stabilité des Top2 ^{(Yun et al.,} ₂₀₀₄₎ Top2 MDC1 Protéine de point de contrôle ^{(Luo et al.,} ₂₀₀₉₎ Top2 PIN1 ^{Terminaison de la réplication et condensation des} _chromosomes ^{(Cuvier et al.,} 2008) Top2 Toposome Fonction non déterminé, complexe multiprotéique ^{(Lee et al.,} ₂₀₀₄₎ Top2 Sgs1/BLM/RECQL5 Progression du cycle cellulaire

Top2 / ! HDAC1 répression de l'expression des gènes ^{(Tsai et al.,} ₂₀₀₀₎ Top2 / ! HDAC2 répression de l'expression des gènes ^{(Tsai et al.,} ₂₀₀₀₎

Top2 / ! CK2 Protéine kinase

(Ackerman et al., 1985; Ahn et al., 2001; Cardenas and Gasser, 1993; DeVore et al., 1992; Isaacs et al., 1998; Redwood et al., 1998)

Top2 / ! Ku 70 / Ku 80 NHEJ et transcription

(Ju et al., 2006; Ju and Rosenfeld, 2006)

Top2 / ! p53 Suppreseur de tumeurs ^{(Cowell et al.,} ₂₀₀₀₎ Top2 / ! SUMO 1/2/3 Diverses fonctions cellulaires ^{(Mao et al.,} ₂₀₀₀₎ Top2 ! PARP Fonction multiple notamment la réparation de l'ADN ^{(Ju et al., 2006;} McNamara et

al., 2008) Top2 ! RAR Régulation de la transcription ^{(McNamara et} _{al., 2008)} Top2 ! TOPBP1 Contrôle des dommages à l'ADN ^{(Yamane et al.,} 1997; Yamane

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V. Les Top2 sont des cibles majeures de

molécules utilisées dans les traitements