Les expériences de pulldown sur les lignées cancéreuses HeLa et RS4,1

Nous avons décidé de réaliser des expériences de pulldown surtout dans le but d’identifier de potentielles cibles cellulaires de la doxorubicine qui auraient des points de fixation sur la molécule différents des Top2, malgré les résultats mitigés obtenus lors des tests in vitro. Ceci afin de déconvoluer des autres cibles potentielles de la doxorubicine. Les pulldown ont été réalisés avec les sondes MR-0081 (Figure 77) et MR-0142 (Figure 81).

MR-0081 MR-0142

Noyaux cellules HeLa Cellules RS4, 11

Myeloperoxidase XRCC5 Polymeric immunoglobulin receptor XRCC6

Lysozyme C PRKDC

Ig gamma-1 chain C region TBA4A Ig gamma-3 chain C region

Arginase-1

Zinc-alpha-2-glycoprotein Lactotransferrin

Heat shock 70 kDa protein 1-like

Tableau 13 Cibles protéiques capturées lors des pulldown avec les sondes 0081 et MR-0142.

i. Expériences de « Pull Down » sur cellules HeLa avec la première sonde MR-0081.

Dans un premier temps une expérience a été réalisée sur un extrait total de cellules

HeLa pour la mise au point de ces expériences. Parmi les 55 protéines capturées, seules 2 protéines, la Filaggrin-2 et la Glutathione S-transferase P ont été validées selon les conditions énoncées. Cependant vu la faible quantité de protéines nucléaires capturées, nous avons décidé de réaliser la même expérience mais sur un extrait enrichi en noyaux de cellules HeLa. Parmi les 121 protéines capturées, 9 ont été validées selon nos critères de protéomique (Tableau 13). 4 parmi elles interviennent dans la réponse immunitaire et 3 d’entre elles appartiennent à des voies métaboliques. Ceci est certainement dû à la préparation de l'extrait enrichi en noyaux mais débarrassé des membranes externes de manière incomplète (Figure 83).

Finalement nous avons conclu que les cellules HeLa n’était pas forcément le modèle d’étude le plus adapté pour nos expériences. Nous avons donc décidé de réaliser une expérience sur des cellules RS4, 11, probablement plus sensibles à la doxorubicine. Parmi les 12 protéines capturées, 2 ont été validées par nos critères, TBB4B (Tubulin 4B Chain) et TBA3C (Tubulin ! 3C/D chain).

Figure 83 Cibles de la sonde MR-0081. a. Processus biologiques dans lesquels les cibles sont impliquées. b. Localisation cellulaire des cibles.

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ii. Expériences de pulldown sur les cellules RS4,11 avec la 2ème

sonde améliorée MR-0142

Nous avons réalisé d’emblée une expérience sur des cellules RS4, 11. Parmi les 525 protéines identifiées, 4 protéines ont été validées selon nos critères. Les cibles sélectionnées sont différentes de celles capturées par la sonde MR-0081 (Tableau 13). Elles sont impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques, la croissance cellulaire et la réponse cellulaire au stress. La majorité sont nucléaires ou cytoplasmiques (Figure 85 a. et b.).

Nous avons ensuite réalisé une expérience de compétition dans laquelle la doxorubicine native est ajoutée dans l’extrait cellulaire avant l’expérience de pulldown (0,2 mM). Dans cette expérience soustractive, les cibles spécifiques de la doxorubicine sont capturées par la doxorubicine libre et ne se fixent plus sur la colonne fonctionnalisée avec la sonde. En comparant les protéines capturées dans cette expérience avec celles capturées lors des pulldown classiques nous avons réalisé une validation croisée des protéines qui, si elles sont spécifiques de la doxorubicine, sont absentes du test de compétition (Figure 85 c.). Nous avons de cette manière éliminé de nombreuses protéines et validé 4 cibles de façon certaine (Tableau 13).

Parmi les complexes retenus par la sonde, nous avons identifié XRCC5 (Ku80), XRCC6 (Ku70) et la DNPK, trois protéines qui appartiennent au complexe de réparation de coupure double brin de l’ADN, composé de trois sous-unités au total. Le complexe Ku est très abondant dans la cellule (500 000 copies par cellule), il possède une grande affinité pour l’ADN. Il reconnait et se lie aux extrémités d’ADN double brin libre, servant ainsi de protection des extrémités libres et de guide pour l’alignement des brins d’ADN pour la religation et pour finir de bases pour le recrutement du complexe de réparation de l’ADN (NHEJ = Non-homologous end joining) (Fell and Schild-Poulter; Walker et al., 2001). Ce complexe agit avec la kinase DNA-PK que nous avons également identifiée avec la sonde MR-0142, PRKDC (DNA-dependent protein kinase catalytic subunit). Cette protéine kinase interagit avec le domaine C-terminal de Ku80. Son recrutement au niveau des cassures double brin génère une série de phosphorylations qui vont participer au recrutement de la machinerie NHEJ (Grundy et al.).

Les cellules cancéreuses de manière générale présentent une instabilité génomique et de nombreux évènements de réparation/recombinaison peuvent avoir lieu. Ceci explique

l’abondance des complexes Ku (Ku70/Ku80/DNPK) et notre résultat de pulldown indique que la doxorubicine pourrait piéger ces complexes de façon massive.

Selon nos informations, et au moment de la rédaction de ce manuscrit, c’est la première fois qu’il est montré que la doxorubicine est capable de fixer le complexe Ku70/Ku80.

Ces expériences ne donnent cependant que peu d’informations sur les bases moléculaires de la fixation de la doxorubicine sur ce complexe. Est-ce une fixation sur la partie protéique du complexe ou cette interaction est-elle médiée par l’ADN ?

Figure 84 Structure cristallographique du complexe Ku70/Ku80-ADN. Les protéines Ku70 (Jaune) et Ku 80 (Rouge) qui encerclent l’ADN (Gris) adoptent une forme de « berceau ».

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Au moment de la préparation du lysat cellulaire, des DNases ont été ajoutées au mélange pour libérer les complexes liés à l’ADN. Cependant il est possible que des fragments d’ADN soient restés protégés au sein du complexe. Lors du passage de l’extrait sur les billes fonctionnalisées avec la sonde, l’ADN présent dans le complexe Ku a pu être capturé par la doxorubicine. D’un point de vue structural, le dimère Ku70/80 forme un « berceau », il ne couvre donc pas totalement l’extrémité de l’ADN à laquelle il est fixé (Walker et al., 2001) (Figure 84). De plus, Schonn et al. ont émis l’hypothèse que les extrémités d’ADN avec des cassures doubles brins générées par la doxorubicine présentent une distorsion qui limiterait l’accès des complexes de réparation, mais qui semblerait être reconnue sans difficulté par le complexe Ku (Schonn et al., 2010). Selon ces éléments il semblerait que les complexes Ku soient capables de se fixer sur des cassures doubles brins en présence, et à proximité, de molécules de doxorubicine.

Afin de valider ces hypothèses et d’en élucider le mécanisme, nous avons entrepris l’étude in vivo du recrutement des complexes Ku sur les cassures induites par la doxorubicine sur des cellules cancéreuses en culture par immunofluorescence.

Figure 85 Expériences de pulldown réalisées avec la sonde MR-00142. a. Processus biologiques dans lesquels les cibles de la sonde MR-00142 sont impliquées. b. Localisation cellulaire des cibles protéiques. c. Principe de l’expérience de compétition réalisée avec la doxorubicine native. L’extrait cellulaire est mis en présence de la doxorubicine native puis de la sonde MR-0142. d. Processus biologiques dans lesquels les cibles sélectionnées après l’expérience de compétition sont impliquées. e. Localisation cellulaire des cibles de l’expérience de compétition.

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2. Validation in cellulo de la cible Ku80 par