Les deux mutants ont été sous-clonés et purifiés de la même manière.
i. Clonage, production et purification des mutants
Nous avons introduit les mutations en une étape PCR en utilisant le kit « Quick change II XL Site-Directed Mutagenesis » (Agilent Technologies). Ce kit est basé sur la technique de mutagénèse dirigée par « rolling circle ». Les mutants ont été produits et purifiés avec les protocoles mis en place pour lenzyme sauvage (Figure 55a.b.). Les rendements et la qualité des enzymes sont équivalents à ceux de lisoforme sauvage.
Figure 54 Le résidu K168 est engagé dans une liaison hydrogène avec le phosphate " de lAMPPNP dans la structure du domaine ATPase de lisoforme (PDB : 1ZXM).
139 Figure 55 Purification des mutants ponctuels K1681 a. et K278A b. Les éluâts de la première étape de purification montrent un enrichissement important et équivalent à lenzyme non muté. 1 : extrait total, 2 : Flow through protéines non retenues, 3, 4, 5 : lavages à 20 mM 35 mM 60 mM Imidazole, 6 : éluât.
ii. Les analyses fonctionnelles des mutants
Les tests de relaxation dun ADN plasmidique surenroulé
Nous avons réalisé des tests de relaxation dADN plasmidique sur les deux mutants.
Le mutant K278A : est actif en relaxation dès la concentration de 9nM (Figure 56a.). Nous avons vu que lenzyme sauvage est active dès 8nM dADN plasmidique (paragraphe C ci-dessus) Nous en avons conclu que cette mutation naffecte pas lactivité de relaxation de lenzyme. De plus la constante catalytique (Kcat) de ce mutant est identique à lenzyme sauvage. Cette mutation naffecte pas lactivité de lenzyme ni pour le passage de brins, ni pour lhydrolyse dATP.
Le mutant K168A : est inactif dans les tests de relaxation de lADN. (Figure 56b.) La mutation abolit complètement lactivité de passage de brin dADN de lenzyme. Cependant cette mutation naffecte pas la capacité de lenzyme à fixer et cliver un ADN double brin, comme le montre le test de clivage (Figure 56c.). Le résidu K168 est donc indispensable pour lactivité de passage de brin de lenzyme mais ne semble pas avoir dimpact sur la capacité de fixation et de clivage de lenzyme. Ce résultat est appuyé par les observations faites sur la structure de Wei et al. (Wei et al., 2005). La position du résidu dans la poche de
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fixation de lATP indique quil pourrait avoir un rôle majeur dans la stabilisation de lATP et donc dans la transmission du signal de lhydrolyse au reste de la molécule (Figure 54).
Tests de décaténation sur le mutant K168A
Nous avons réalisé des tests de décaténation dun réseau dADN pour valider labolition de lactivité de passage de brins du mutant K168A (Figure 57) Ces tests consistent à mettre les protéines en présence de réseaux dADNk (ADN kinétoplastique). Les Top2 agissent en séparant deux ADNs entrecroisés. On observe lactivité de décaténation par lapparition dADN minicercle de 2.5Kb lors de la migration sur gel dagarose alors que lADNk reste dans le puits.
Nous avons observé que le mutant est totalement inactif comparé à lenzyme sauvage dont on peut observer une bande dADN 2.5Kb jusqu'à 5nM denzyme (Figure 57). Nous avons confirmé que le mutant K168A ne possède plus dactivité de passage de brins, que ce soit en présence dADN surenroulé (tests de relaxation) ou en présence dADN caténé. e résidu lysine K168 est donc directement impliqué dans le cycle catalytique de lenzyme. Ce résidu est donc un point charnière de la coordination de lhydrolyse dATP et le passage des brins dADN par le corps de lenzyme.
141 Figure 57 Tests de décaténation du mutant HsTop2 K168A. c1 = contrôle dans protéine ADN décaténé c2= contrôle sans protéine ADN linéaire c3 = contrôle sans protéine ADN caténé. oc = open circular, ADN avec une coupure simple brin l= ADN linéaire dk= ADN décaténé. De 1 à 3 43nM, 13 nM et 5 nM de mutant K168A. de 4 à 6 43 nM, 13nM, 5nM denzyme sauvage.
Figure 56 Tests de relaxation et clivage des mutants K168A et K278A. oc = open circular , ADN avec une coupure simple brin, sc = supercoiled, ADN surenroulé. a. Test de relaxation du mutant K278A. c= contrôle contenant de lADN surenroulé sans protéine. de 1 à 5 : 72 nM, 36nM, 18 nM, 9nM, 4,5 nM de Top2 K278A pour une concentration constante dADN 100ng. b. Test de relaxation de Top2 sauvage et Top2 mutante K168A. c1 = contrôle sans protéine contenant de lADN linéarisé, c2= contrôle sans protéine contenant de lADN surenroulé. de 1 à 4 72nM, 36nM, 18nM et 9nM de Top2 sauvage. De 5 à 8 72nM, 36nM, 18nM et 9nM de Top2 K168A. c. Test de clivage en présence détoposide. Les contrôles sont les mêmes que pour b. 1 à 4 72nM, 36nM, 18nM et 9nM de Top2 sauvage. De 5 à 8 72nM, 36nM, 18nM et 9nM de Top2 K168A.
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Détermination des constantes cinétiques, Kcat et Km, du mutant K168A.
Afin de vérifier dans quelle mesure la mutation du résidu K168 impacte lhydrolyse de lATP, nous avons déterminé les constantes cinétiques Kcat et Km de ce mutant. Nous avons utilisé le même protocole que celui décrit pour lenzyme sauvage. Une concentration en enzyme 5 fois supérieure à la concentration habituelle en Top2 (375 nM au lieu de 72 nM) a été nécessaire pour pouvoir détecter la consommation dATP.
Les constantes catalytiques et de Michaelis ont été déterminées avec les valeurs respectives de Kcat = 0,31 ± 0,06 s-1 Km = 205 ± 60 µM (Figure 58). Lefficacité catalytique
(Kcat/Km) du mutant est par conséquent de keff= 1,5 M-1.s-1. Il a été précédemment établi que lisoforme sauvage que nous produisons en levure S.cerevisiae possède un Kcat = 2
± 0,035 s-1 et un Km = 280 ± 90 µM avec une efficacité de keff = 7,14 M-1.s-1. Le mutant K168A est donc 4,6 fois moins efficace que lenzyme sauvage que nous produisons (Tableau 11).
143 Nous avons observé que la constante de Michealis, Km, est équivalente pour lenzyme sauvage produite en levure et le mutant. C'est-à-dire que lactivité maximale des deux enzymes est atteinte pour une quantité en substrat équivalente. Laffinité pour lATP est la même pour les deux enzymes. Cependant le « turn-over » du mutant est 6 fois inférieur à celui de lenzyme sauvage. Nous pouvons donc en conclure que la mutation de la lysine 168 en Alanine affecte lhydrolyse de lATP sans affecter la fixation de ce dernier. Il est probable que le positionnement de la molécule dATP dans la poche avant le déclenchement de lhydrolyse ne soit pas optimal ou que la libération des produit ADP + Pi soit affectée.
Nous avons voulu vérifier si labolition complète de lactivité de relaxation était corrélée à la baisse de lefficacité de lenzyme de 4,6 fois. En augmentant la quantité denzyme on devrait pouvoir observer des intermédiaires de relaxation. Nous avons donc réalisé un test de relaxation dADN plasmidique en augmentant le ratio molaire ADN:Protéine à 1:2,5 et 1:6,5. Aucune activité du mutant nest détectée lors de ce test (Figure 59). Nous pouvons en
Figure 58 Vitesse dhydrolyse dATP du mutant K168A en fonction de la concentration en ATP. La cinétique a été réalisée en triplicatas.
Tableau 11 Constantes cinétiques du mutant K168A comparé à lenzyme sauvage.
Constante Catalytique Kcat s!1 Constante de Michealis Km (µM) Efficacité catalytique (Kcat/Km) M!1.s!1 Sauvage 2 280 7,14 Mutant K168A 0,3 205 1,50
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conclure que la lysine 168 intervient dans la stabilisation de lATP et quelle est indispensable pour lactivité de passage de brin du corps catalytique de lenzyme.
Lensemble des résidus de la poche de fixation de lATP forme un réseau dinteraction permettant un positionnement correct de lATP. Toute modification dans ce réseau serait susceptible de venir perturber lefficacité de lhydrolyse de lATP et donc le cycle catalytique de lenzyme de manière plus ou moins importante en fonction du résidu modifié. West et al. en 2002 ont mené une étude similaire (West et al., 2002). Ils ont muté la sérine 165 de lisoforme en Arginine (S148 chez lisoforme !). Ce résidu est situé dans l « ATP lid ». Ce mutant a les mêmes caractéristiques que le nôtre. Le Kcat est diminué de 7 fois, lactivité de passage de brin diminuée de 80%, mais aucun impact na été révélé sur le clivage et la fixation de lADN.
Figure 59 Augmentation de la concentration de K168A en test de relaxation. C = contrôle sans protéine. oc = open circular, ADN avec une coupure simple brin, r = ADN relâché, sc = ADN surenroulé. 1 et 2 enzyme mutant K168A au ratio de 1:2.5 et 1:6.5 (ADN : Protéine, en ng). 3 et 4 enzyme sauvage au ratio 1:2.5 et 1:6.5.
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