Optimisation des conditions de synthèse de l’aminoalcool

Cette approche a été inspirée des travaux du groupe Rengaraju et al. 12 L’étape de substitution reste l’étape clef, les conditions doivent permettre d’obtenir une bonne sélectivité entre la O-alkylation et la N-alkylation. Zhu et al. ont démontré la possibilité d’effectuer cette substitution nucléophile aromatique sélectivement sur l’azote, dans le DMF en présence de carbonate de potassium.13 Lamb et al. ont aussi décrit cette réaction de substitution dans le butanol en présence de diisopropyléthylamine à 60 °C(Figure 17). 14

20

Figure 17. Synthèse par substitution nucléophile aromatique par l’équipe de Lamb et de Zhu

Ces conditions ont été testées au laboratoire. La réaction avec la DIPEA n’a pas permis d’observer le produit. En présence de carbonate de potassium une conversion de 50% dans un mélange 2/1 de N- et de O-alkylation a été observée (Figure 18).

Figure 18. Chromatogramme de la substitution nucléophile aromatique en présence de carbonate de potassium

Produit de départ

N-alkylé

21

En nous basant sur les résultats du premier essai et le plan d’expérience du composé 1, une sélection de trois bases et cinq solvants, nous ont permis d’optimiser rapidement nos conditions. Cette fois-ci, nous avons décidé de faire varier le solvant et la base en parallèle et non pas en séquence. Le Cs2CO3 et la DIPEA ont été évalués avec le DMF, la NMP et le

DMSO, tandis que le BEMP a été évalué dans des solvants aprotiques et apolaires (DCM et Toluène). Le produit désiré a été formé dans toutes les conditions testées et nous n’avons pas vu de trace de l’isomère O-arylé (Tableau 7).

Solvant ε Base Température 10 (%) Imp (%) 2 (%)

DMF 36.7 Sans base 100 °C 81 19 0 DMF 36.7 Cs2CO3 100 °C 45 13 43 DMSO 46.7 Cs2CO3 100 °C 20 14 66 NMP 32.6 Cs2CO3 100 °C 39 11 49 DMF 36.7 DIPEA, 100 °C 67 10 23 DMSO 46.7 DIPEA 100 °C 78 6 16 NMP 32.6 DIPEA 100 °C 75 7 17 Toluène 2.4 BEMP 100 °C 47 33 19 DCM 8.9 BEMP 30 °C 54 9 37

Tableau 7. Conversion en composé 2 en fonction de la base et du solvant 15 16

Une fois les conditions optimales identifiées (surlignées dans les tableaux 6 et 7), les deux réactions ont été effectuées sur 500 mg de composé 10 et ont permis d’isoler 722 mg soit 63.5 % de rendement de l’oxazolidinone 1 et 495 mg soit 47% de rendement de l’aminoalcool 2.

22

L’iChemExplorer® a permis de rapidement tester différentes conditions opératoires en jouant sur les réactifs, les solvants et la température. Son impact en temps réel sur la résolution d’une problématique dans un projet actif a pu ainsi être démontré.

3.2

Étude cinétique

Avec des prélèvements HPLC automatiques et programmables, l’iChemExplorer® est un outil idéal pour suivre des cinétiques réactionnelles. Une série de composés développés dans un programme récent a montré un métabolisme particulier avec le déplacement d’un chlore électrophile par du glutathion dans des hépatocytes humains. Nous avons voulu vérifier si cette réaction avec le glutathion nécessitait une enzyme ou si elle pouvait se produire en présence de glutathion seul.

Le glutathion est un petit peptide composé de 3 acides aminés qui sont la glycine, la cystéine, et l’acide glutamique (Figure 19). Selon Mindell, il s’agit du « maître antioxydant ». En effet, il est présent dans 90% des cellules de notre organisme et permet de le protéger de tous les oxydants. 17

De nombreux auteurs ont travaillé sur le glutathion et sa capacité, à travers son groupement thiol, à se lier de façon covalente à certaines fonctions électrophiles comme le groupement nitrile, les accepteurs de Michaël ou encore les hétéroaromatiques pauvres en électron. 18192021 Cette réactivité peut dans certains cas être liée à une toxicité aigüe.

Nous nous sommes inspirés des conditions décrites dans les références citées ci- dessus afin d’étudier la probable dégradation de nos composés. Les molécules 22, 23 et 24 ont été mises en solution en présence de glutathion dans un milieu tampon phosphate à pH 7 et à 37 °C. Le suivi HPLC de la dégradation de ces composés a été ensuite effectué sur l’iChemExplorer®. Afin d’avoir un temps de départ commun à chaque molécule et une courbe de cinétique juste, le glutathion est ajouté juste avant l’injection (Figure 19).

23

Figure 19. Étude de la dégradation entre les composés 22, 23 et 24 et le glutathion

Les premiers essais n’ont pas été concluants. La faible solubilité des composés dans un milieu tamponné a entraîné un problème au niveau de la répétabilité des injections. Les analyses générées n’ont de ce fait pas été représentatives.

Dans l’optique de s’affranchir de ce problème de répétabilité, un deuxième suivi a été effectué dans un mélange de méthanol et de DMSO (9/1). La solubilité des produits a été ainsi fortement augmentée. Le suivi cinétique a clairement montré une dégradation des composés. Pour illustrer les résultats, seul l’exemple du composé 22 est présenté dans la Figure 20 et montre la diminution du produit de départ, ainsi que l’apparition et l’augmentation de nombreuses impuretés au cours du temps

24

Un inconvénient majeur observé au cours de cette expérience est le problème de solubilité des échantillons. Aucune dilution n’étant possible avant l’injection, les milieux réactionnels doivent être homogènes pour permettre une analyse fiable.

3.3

Application à la chimie combinatoire

Dans l’optique de tester les capacités de l’iChemExplorer® en chimie combinatoire et de vérifier la méthode de transfert de l’UHPLC vers l’HPLC préparative, la synthèse des molécules suivantes a été envisagée (Figure 21). Dans un projet de chimie de Recherche en cours, nous avons eu besoin d’explorer la Relation Structure-Activité autour de la position sulfonamide pour des composés de type 26. Pour cela une série de 41 molécules a été sélectionnée.

Figure 21. Librairie pour la chimie combinatoire

Il existe différentes méthode de synthèse de sulfonamides. Les travaux de Sparks et al. ont montré la possibilité de coupler des anilines directement en présence de chlorure de sulfonyle. La réaction s’effectue en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane, en utilisant de la DMAP comme catalyseur.22 D’autres auteurs ont montré que l’utilisation de la pyridine comme base dans le dichlorométhane ou le THF permettait aussi d’obtenir les sulfonamides désirés. 2324

Au laboratoire, nous avons optimisé les conditions opératoires en nous basant sur les travaux décrits précédemment. Par ailleurs nous avons voulu simplifier le traitement de la réaction pour qu’une simple filtration et une injection en HPLC préparative permette de purifier les composés.

Dans notre étude les groupe R1 et R2 représentent différents groupements aryles,

alkyles ou même hydrogène. La quantité de produit nécessaire pour les tests biologiques n’excédant pas 20 mg, les réactions ont été réalisées sur 50 mg du composé 27 dans un flacon de 2 mL.

L’aniline ou l’amine sélectionnée ont été ajouté au composé 27 préalablement solubilisé dans la pyridine, et le milieu réactionnel chauffé à 45 °C (Figure 22). Ces

25

conditions nous ont paru suffisamment générales pour être utilisées avec l’ensemble de nos amines / anilines.

Figure 22. Synthèse finale de la série de composés 26 développée au laboratoire

Toutes les réactions ont été démarrées en même temps en utilisant l’appareil proche de sa capacité maximale. Après 16 h de réaction, l’analyse des chromatogrammes sur le logiciel a permis de rapidement interpréter les résultats. Une analyse préalable du composé 27, nous a permis et de connaître son temps de rétention. Au total, 39 produits sur 41 ont été formés. Une analyse UHPLC couplée avec un spectromètre de masse a été effectuée afin de vérifier si les composés formés correspondaient aux produits attendus. Puis toutes les réactions ont été traitées et les bruts réactionnels purifiés par HPLC-préparative en se basant sur la méthode de transfert. Les produits purifiés ont ensuite été séchés dans le Génévac® HT6. Il s’agit d’une centrifugeuse qui permet une évaporation sous vide (Figure 22).

Figure 23. Appareil de séchage Génévac® HT6

Les produits obtenus ont alors été analysés dans les conditions standards d’analyse de produits finaux en Chimie de Recherche : une analyse sur UHPLC couplée avec un

26

spectromètre de masse avec une méthode analytique de 12 minutes en utilisant un gradient d’élution plus lent que la méthode analytique de l’iChemExplorer®. Cette dernière permet d’obtenir une meilleure résolution chromatographique. Une analyse RMN est aussi nécessaire pour confirmer la structure et vérifier la pureté. Pour les molécules qui ne possèdent pas de chromophores, une analyse RMN est indispensable pour déterminer la pureté.

On obtient 39 produits avec des rendements variant de 15 à 84% et une pureté en moyenne supérieure à 90% (Tableau 8).

N° Aniline Puretés (%) Rendement (%) Commentaires

26-1 99.2 78.3 _- 26-2 - 15.0 Mélange de 2 composés 1/1 et 26-3 99.7 55.5 - 26-4 99.9 57.0 - 26-5 100 57.0 - 26-6 100 41.0 - 26-7 100 44.0 - 26-8 100 69.0 -

27

N° Aniline Puretés (%) Rendement (%) Commentaires

26-9 98.8 80.0 - 26-10 100 75.5 - 26-11 - 0 - 26-12 96.6 69.0 - 26-13 100 21.0 26-14 100 19.0 - 26-15 89.5 28.0 26-16 68.0 55.7 30% du produit ci-dessous 26-17 99.5 70.0 - 26-18 100 75.0 - 26-19 100 37.0 - 26-20 100 80.0 -

28

N° Aniline Puretés (%) Rendement (%) Commentaires

26-21 100 47.0 - 26-22 99.0 56.0 - 26-23 99.5 83.6 - 26-24 100 79.0 - 26-25 97.6 61.0 - 26-26 100 18.0 -

26-27 - 0.0 Réaction complète mais perte du

produit lors du traitement

26-28 100 57.0 -

26-29 99.2 69.0 -

26-30 100 79.0 -

26-31 100 65.8 -

29

N° Aniline Puretés (%) Rendement (%) Commentaires

26-33 100 65.0 - 26-34 100 64.0 - 26-35 100 79.1 - 26-36 100 67.2 - 26-37 - 0.0 Dégradation 26-38 100 81.0 - 26-39 97.4 79.6 - 26-40 100 72.2 - 26-41 100 72.4 -

Tableau 8. Série des anilines et des composés synthétisés par chimie combinatoire

Lors de la réaction entre les composés 40 et 27, le produit désiré n’a pas été obtenu. En se référant aux travaux de Shinsaku et al.,25 nous suggérons la structure 71, confirmée par RMN, pour ce produit. Un mécanisme possible pourrait être l’ouverture de la pyrrolidine par un ion chlore suivie d’une substitution nucléophile du dérivé chloré par la pyridine (Figure 24).

30

Figure 24. Mécanisme réactionnel proposé pour la synthèse du composé 76

Lors du séchage du composé 26-16 au Génévac® en sortie d’HPLC préparative, nous avons observé que ce dernier se dégradait. L’hydrolyse du composé 26-16 par l’action de l’acide formique contenu dans la phase éluante conduirait ainsi à une ouverture de cycle et l’obtention du composé 73. En se basant sur les travaux de Dixon et al.26 _{le mécanisme}

réactionnel suivant peut être proposé (Figure 25) : l’ouverture de l’hémiacétal suivie par une perte d’une molécule de benzaldéhyde.

31

Figure 25. Mécanisme réactionnel proposé de la dégradation du composé 26-16

Le produit attendu de la réaction entre les composés 27 et 64 n’a pas été observé. Les dérivés de benzoxazoles pouvant parfois être des composés peu stables, nous avons supposé que le réactif n’était pas stable dans ces conditions. 27 28

Les 39 produits obtenus ont ensuite été répartis dans deux flacons pour les tests biologiques. Ces produits ont permis de répondre rapidement à une hypothèse de l’équipe de design sur la relation structure / activité avec la cible biologique.

Ainsi, l’iChemExplorer® permet un gain de temps essentiellement lors du suivi de la réaction. Le logiciel permet de savoir rapidement si telle réaction a fonctionné ou non. Une bonne organisation est cependant nécessaire afin d’éviter les erreurs de manipulation et les contaminations croisées. La méthode de transfert de l’UHPLC vers l’HPLC préparative a donné les résultats attendus et permis de purifier tous les composés en 48 h. Ainsi nous avons pu synthétiser et purifier nos composés en moins de 72h. La caractérisation des produits et le double flaconnage a pris plus d’une semaine.

32

Mais la chimie combinatoire n’est clairement pas l’application principale pour cet appareil. Le gain de temps reste minime comparé à une approche plus traditionnelle.

3.4

Suivi cinétique chiral en temps réel

Dans l’optique d’évaluer toutes les capacités de l’iChemExplorer®, nous avons voulu coupler l’appareil avec une HPLC chirale. L’uracile 82 (Figure 26) représentait un intermédiaire clef pour un des projets de la Chimie de Recherche. Une synthèse efficace avait été développée à partir de l’intermédiaire optiquement pur 81. Malheureusement, si le produit désiré avait obtenu avec un bon rendement, c’était au détriment de la pureté énantiomérique. Nous avons décidé d’utiliser l’iChemExplorer® pour trouver des conditions minimisant cette racémisation.

Figure 26. Synthèse du composé 87 avant optimisation

Pour effectuer le suivi chiral, il a été nécessaire de trouver des conditions compatibles avec l’iChemExplorer®, les conditions opératoires et le produit désiré. L’analyse est effectuée sur une colonne Chiralpak® Ic 4.6*250mm 5µM à température ambiante avec comme éluant un mélange heptane / éthanol (90 / 10) et 3% d’acide trifluoroacétique à un débit de 1mL / min. En tout l’analyse prend 30 minutes.

Le composé 81 est préparé à partir de l’ester aminé 83. Une première étape consiste à former l’urée en ajoutant l’isocyanate 84. L’urée est ensuite mise en réaction avec l’orthoformiate d’ethyle 86 et le 2-nitroacétate d’éthyle 87 dans le toluène à 100 °C pour obtenir le composé 81 (Figure 27). Parallèlement, la même voie de synthèse est effectuée afin d’obtenir le produit racémique. Ce dernier nous a permis de travailler sur les conditions d’analyse et de déterminer l’excès énantiomérique de notre composé final.

33

Figure 27. Synthèse multi-étapes du composé 81

L’étape de cyclisation s’effectue en milieu basique en présence de 2 équivalents de carbonate de césium à 90 °C dans 20 volumes de DMF pendant 3 h. Dans ces conditions, une pureté optique de 56% est obtenue. Pour réduire l’épimérisation in situ, nous avons fait varier la concentration de notre solution de 20 à 60 volumes afin de réduire la concentration de la base dans le milieu réactionnel. Nous avons aussi documenté l’impact de l’acétonitrile comme solvant (Tableau 9).

Solvant Volume Durée Rapport Composé 82 a/b

DMF 20 30 min 91/9

ACN 20 1 h 94/6

ACN 40 2 h 95/5

ACN 60 3 h 99/1

Tableau 9. Résultats de la pureté optique du composé 82 en fonction du solvant et du volume de ce dernier

34

Les meilleures conditions sont obtenues dans 60 volumes d’acétonitrile (Figure 28).

Figure 28. Synthèse optimisée du composé 82

La pureté optique s’améliore en diminuant la concentration mais cela entraine aussi une cinétique plus longue. Comme on peut le voir sur les analyses (Figures 29 et 30) la réaction est beaucoup plus propre dans l’acétonitrile.

Figure 29. Analyse après 3 h à 90 °C de la réaction dans 20 volumes de diméthylformamide

Figure 30. Analyse après 3 h à 90 °C de la réaction dans 60 volumes d'acétonitrile

Ces travaux représentent, à notre connaissance, la première utilisation de l’iChemExplorer® associé à une HPLC chirale. La durée des analyses dans ces conditions peut cependant être un problème si les cinétiques de réactions sont courtes.

Composé 87-a Composé 87-b

35

3.5

L’utilisation des paliers de température

Une des fonctions de l’iChemExplorer® que nous n’avons pas exploitée est la possibilité de contrôler précisément la température d’une réaction et de la faire varier automatiquement au cours du temps d’une réaction. Le fournisseur suggère par exemple d’étudier la dégradation de composés en fonction de l’évolution de la température au cours du temps soit par palier soit de manière linéaire.

Nous avons pu voir que l’iChemExplorer® est un outil multifonctionnel qui permet d’effectuer différentes opérations comme une optimisation de conditions de synthèse, un suivi cinétique ou chiral ou la synthèse d’une petite chimiothèque. Nous avons ensuite voulu utiliser cet appareil plus en profondeur pour développer deux réactions fréquemment utilisées à Galderma R&D.