Oligomérisation des protéines UGT

Plusieurs évidences in vitro suggèrent la présence et l‘impact fonctionnel d‘interactions protéiques impliquant les UGT. Les complexes formés peuvent être de nature homo- oligomérique, donc impliquant l‘interaction d‘une UGT avec elle-même (ex. 1A1-1A1), mais également hétéro-oligomérique, par la formation de complexes protéiques impliquant plusieurs UGT différentes (ex. 1A1-1A9) (Ghosh 2001; Operana and Tukey 2007). Ces complexes d‘interactions protéiques ont non seulement été détectés dans des modèles in vitro, mais les données fonctionnelles suggèrent également que l‘interaction des protéines UGT entre elles pourrait affecter leur activité enzymatique (Tableau 7). Par exemple, la coexpression d‘UGT1A4 et 1A6 dans les cellules HEK293 mène à la formation de complexes de hauts poids moléculaires. Elle entraîne également une augmentation de l‘activité enzymatique (Vmax : augmentation de 166 %) d‘UGT1A6 envers le diclofénac, un agent anti-inflammatoire (Fujiwara et al. 2007a). Koiwai et collaborateurs ont également identifié chez un patient souffrant du syndrome de Crigler-Najjar un polymorphisme génétique sur un allèle (hétérozygote). Celui-ci mène à la formation d‘une protéine UGT1A1 tronquée (UGT1A1Gln331Stop) (Koiwai et al. 1996). Ce syndrome est causé par une forte diminution de l‘activité de glucuronidation hépatique de la bilirubine par UGT1A1. La coexpression de la protéine inactive (1A1Gln331Stop) avec l‘enzyme UGT1A1 active mène à une diminution de 94 % de l‘activité de glucuronidation envers la bilirubine, et leurs résultats de « pull down assay » supportent l‘interaction physique de ces protéines (Koiwai et al. 1996). Ceci appuie donc le rôle de dominant négatif de la protéine tronquée via la formation de complexes d‘interactions protéiques entre les deux protéines UGT1A1, menant à une diminution significative de la glucuronidation cellulaire.

La mutation de certains domaines protéiques a permis d‘étudier l‘impact de ceux-ci dans les interactions protéine-protéine des UGT. La délétion de la partie N-terminale d‘UGT2B1 du rat (acides aminés 1 à 276) prévient la formation de complexes de hauts poids moléculaires (environ 100-110 kDa). Elle diminue également l‘activité de glucuronidation lors de la coexpression avec la protéine UGT2B1 native (Meech and Mackenzie 1997b). Une mutation en C-terminale (acides aminés 291 à 506) n‘empêche pas la formation de ces complexes. La coexpression de deux protéines UGT2B1 inactives, une dépourvue des acides aminées 493 à 529 (domaine TMD et queue cytosolique) et l‘autre possédant une mutation ponctuelle (L363P), restaure en partie l‘activité de glucuronidation envers la testostérone. Ces données suggèrent que le domaine transmembranaire (TMD) et la

queue cytosolique des monomères n‘interagissent pas ensemble (Meech and Mackenzie 1997b). Des données supplémentaires supportent ces évidences. En effet, Kurkela et collaborateurs ont enlevé le domaine transmembranaire et la queue cytosolique d‘UGT1A9 (UGT1A9sol). La coexpression de cette protéine avec UGT1A4 entraîne une modulation de l‘activité enzymatique envers des substrats spécifiques, soit l‘entacapone et la scopolétine. Ceci suggère que ces protéines aient préservé leur potentiel d‘interaction (Kurkela et al. 2004a). Par contre, plusieurs de ces données sont dérivées d‘évidences indirectes, telles des expériences de surexpression hétérologue et des essais enzymatiques. Un polymorphisme génétique d‘UGT1A9 (C183G), situé dans la partie N- terminale de la protéine, est également lié à la perte de dimérisation de cet UGT (Olson et al. 2009). Les cystéines sont des résidus fortement conservés entre les UGT1A, même chez plusieurs UGT2B (Ghosh et al. 2005). L‘oxydation de ces résidus permet la formation de ponts disulfures qui sont des interactions protéiques de forte affinité (covalentes). L‘impact de cette mutation sur l‗oligomérisation d‘UGT1A9 supporte que les protéines UGT puissent interagir via la formation de ce type de liens covalents. Ceci suggère également que la partie N-terminale des protéines UGT soit importante pour leur oligomérisation. D‘autres évidences supportent également la formation de ce type de complexes par l‘utilisation de gels non réducteurs qui possèdent des conditions permissives pour la formation de ponts disulfures (Meech and Mackenzie 1997b; Ghosh 2001).

De plus, l‘étude de ces interactions protéiques supporte que les protéines UGT puissent exister sous plusieurs formes. En effet, l‘utilisation de techniques diverses, telles les gels natifs et l‘inactivation par la radiation, suggère la présence de complexes de hauts poids moléculaires (entre 100 et 200 kDa). Le poids moléculaire des complexes supporte la dimérisation et la tétramérisation des UGT. Néanmoins, ces expériences démontrent également la présence d‘une grande quantité de monomères (environ 50 kDa) (Peters et al. 1984; Gschaidmeier and Bock 1994; Ikushiro et al. 1997; Meech and Mackenzie 1997b; Ghosh 2001; Fujiwara et al. 2007a; Olson et al. 2009; Fujiwara et al. 2010). Par contre, nous ne pouvons exclure que ces monomères puissent également former des complexes protéiques de plus faible affinité. Ces complexes pourraient être détruits lors de la préparation des échantillons et par l‘utilisation de détergents.

Les évidences suggèrent que les interactions protéiques entre les UGT soient possibles entre les membres d‘une même famille (1A-1A), mais puissent également survenir entre

des membres de familles différentes (1A-2B) (Ikushiro et al. 1997; Fremont et al. 2005; Kurkela et al. 2007; Fujiwara et al. 2010; Fujiwara and Itoh 2013). Par exemple, l‘interaction entre UGT2B7 et 1A1/1A6 a été identifiée dans des microsomes de foies humains par l‘équipe de Fremont (Fremont et al. 2005). La fonction de ces interactions reste par contre à être élucidée.

La complexité de ces interactions et le rôle potentiel sur l‘activité de glucuronidation suggèrent que les interactions protéiques entre les UGT puissent permettre d‘augmenter la diversité des substrats métabolisés par ces enzymes (Ishii et al. 2004; Fujiwara et al. 2007a; Fujiwara et al. 2007b; Kurkela et al. 2007). La majorité de ces études utilise des systèmes de surexpression cellulaire. Néanmoins, plusieurs protéines UGT sont exprimées dans un même tissu, supportant l‘importance d‘étudier la coexpression de ces différentes protéines UGT. Les évidences suggèrent que les interactions protéiques entre les UGT puissent influencer la régio-sélectivité de l‘activité transférase de ces protéines (UGT2B21-2B22; activité morphine 3-G, 6-G). Elles pourraient également restaurer une partie de l‘activité de glucuronidation en présence de polymorphismes génétiques (UGT1A6Y485D-1A4; augmentation de la glucuronidation de la sérotonine) (Ishii et al. 2001; Kurkela et al. 2007). D‘autres enzymes du métabolisme des médicaments, particulièrement les cytochromes P450, ont été identifiées comme partenaires d‘interaction avec les protéines UGT (Taura et al. 2000; Fremont et al. 2005; Takeda et al. 2005a; Takeda et al. 2005b; Ishii et al. 2007; Takeda et al. 2009; Ishii et al. 2014). Ces interactions protéiques ont elles aussi le potentiel d‘influencer l‘activité de glucuronidation cellulaire. Par exemple, la coexpression de CYP3A4 avec UGT2B7 augmente le Km de cette dernière envers la morphine-3 (9 fois) (Takeda et al. 2009). De plus, des évidences suggèrent qu‘UGT1A1 puisse interagir avec GSTA2 (Akizawa et al. 2008). Les interactions protéiques entre les enzymes du métabolisme des médicaments suggèrent un mécanisme de coopération fonctionnelle, pouvant potentiellement faciliter le transfert entre les différentes étapes du métabolisme des xénobiotiques.

Néanmoins, l‘étude des interactions protéiques est rarement réalisée à l‘aide de sources de protéines endogènes, telles des tissus humains et des lignées cellulaires possédant une expression endogène de ces protéines. Quelques exemples utilisant des préparations microsomales de foies de rat ou d‘humain sont rapportés. Par contre, ces études évaluaient les interactions protéiques de certaines UGT de façon ciblée (Peters et al.

2005; Ishii et al. 2007; Fujiwara and Itoh 2013). Par exemple, Fujiwara et collaborateurs ont immunoprécipité UGT2B7 et détecté par immunobuvardage les UGT1A1/6, sans considérer le potentiel d‘interaction plus étendu de ces enzymes (Fujiwara et al. 2010). Une seule étude rapporte la caractérisation non ciblée de l‘interactome des protéines UGT dans des microsomes de foies humains. Cette étude a utilisé la purification d‘affinité combinée à la spectrométrie de masse (Fujiwara and Itoh 2013). Par contre, elle a seulement confirmé par la technique de co-immunoprécipitation (co-ip) les interactions entre les protéines UGT, laissant de côté les autres partenaires identifiés (Fujiwara and Itoh 2013). De plus, une très grande quantité d‘anticorps (200 µL) non purifiés était utilisée, pouvant augmenter les interactions non spécifiques entre les anticorps et les protéines abondantes du lysat cellulaire. L‘absence de détergent doux permettant de solubiliser la membrane du RE dans laquelle les UGT sont insérées peut également représenter un point faible de l‘étude. En effet, les protéines immunoprécipitées peuvent être résidentes de la membrane du RE et former des agrégats membranaires, sans nécessairement interagir avec la protéine cible UGT2B7. Finalement, les critères d‘identification protéique nécessiteraient d‘être plus stringents. En effet, les auteurs ont déterminé l‘identification de plusieurs protéines sur la base d‘une seule séquence peptidique. L‘existence de similarité de séquence dans plusieurs familles protéiques, telles les UGT et les CYP450, requiert l‘utilisation de critères plus stricts afin d‘assurer un niveau de confiance élevé dans la différenciation des protéines identifiées.

Il devient donc nécessaire d‘étudier ces interactions protéiques complexes dans un modèle tissulaire où un mélange d‘UGT est exprimé et où ces protéines sont connues pour avoir des fonctions importantes, telles dans les tissus impliqués dans le métabolisme des médicaments (foie, rein, tractus gastro-intestinal). Sachant que l‘enzyme et la protéine alternative ont le potentiel d‘interagir entre elles, il devient nécessaire de comprendre comment ces interactions protéiques affectent l‘activité de glucuronidation. De plus, l‘identification de l‘interactome de formes d‘épissage présente un aspect novateur peu étudié jusqu‘à maintenant qui pourrait permettre de découvrir de nouvelles fonctions pour ces protéines UGT.

Tableau 7. Oligomérisation des protéines UGT et leur impact fonctionnel.

Enzymes / Partenaires Données fonctionnelles Méthodes utilisées Références UGT-UGT

UGT (rat)

Hétéro-oligomères Inactivation par la radiation (microsomes de foie de rat) (Peters et al. 1984) UGT

(rat) Hétéro-dimères/tétramères Inactivation par la radiation (microsomes de foie de rat) (Gschaidmeie r and Bock 1994) 1A-2B1

(rat) Hétéro-oligomères Crosslink et immunopurification sur support solide (microsomes de foie de rat)

(Ikushiro et al. 1997)

2B1

(rat) Homo-dimères Expression hétérologue/ Immunobuvardage (Cos-7) (Meech and Mackenzie 1997b) 2B1-2B1.291 (rat)

Dominant négatif Expression hétérologue/ Immunobuvardage (Cos-7) (Meech and Mackenzie 1997b) 2B1.493 - 2B1L363P

(rat) Restaure l‘activité de glucuronidation des deux mutants inactifs

Expression

hétérologue (Cos-7) (Meech and Mackenzie 1997b) 2B21-2B22 (cochon d‘Inde)  chloramphénicol-G et influence régio-sélectivité de morphine-G Expression hétérologue (Cos-7) (Ishii et al. 2001; Ishii et al. 2004) 1A1/3/4/6/7/8/9/10 Homo-oligomères FRET/Co-ip (Cos) (Operana and

Tukey 2007)

1A1

1A1 Homo-dimères/ oligomères Double-hybride en levure/Gel non réducteur (fibroblastes de rat) Co-ip (microsomes de foie humain) Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Ghosh 2001; Fremont et al. 2005; Fujiwara et al. 2007a)

1A1/3/4/6/7/8/9/10 Hétéro-oligomères FRET/Co-ip (Cos) (Operana and Tukey 2007) 1A1Q311X Dominant négatif

(bilirubine-G)

Expression hétérologue (Cos)

(Koiwai et al. 1996) 1A1C223Y Dominant négatif

(bilirubine-G) Double-hybride en levure/Expression hétérologue (Cos-7)

(Ghosh 2001)

1A1C127Y Dominant négatif

Enzymes / Partenaires Données fonctionnelles Méthodes utilisées Références

1A4  Vmax (S)-4‘-HPPH O-G et (R)-4‘-HPPH O-G Expression hétérologue (HEK293) (Nakajima et al. 2007) 1A4 Hétéro-dimères/  S50 et

Vmax estradiol 3-O-G/  S50 bilirubine O-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Fujiwara et al. 2007a) 1A6 Hétéro-dimères/  S50 et

 Vmax estradiol 3-O-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293)

(Fujiwara et al. 2007a) 1A6  Vmax (S)-4‘-HPPH O-G

et (R)-4‘-HPPH O-G Expression hétérologue (HEK293)

(Nakajima et al. 2007) 1A6 Hétéro-oligomères Co-ip (microsomes

de foie humain)

(Fremont et al. 2005) 1A9  Km et  Vmax propofol-

O-G Expression hétérologue (HEK293)

(Fujiwara et al. 2007b) 2B7  S50 estradiol 3-O-G Expression

hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010) 1A1_i2  bilirubine-G et estradiol-

G Expression hétérologue/Co-ip (HEK293) (Levesque et al. 2007) 1A4

1A4 Homo-dimères Expression hétérologue /Gel natif (HEK293)

(Fujiwara et al. 2007a) 1A1 Hétéro-dimères/  Vmax

imipramine N-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Fujiwara et al. 2007a) 1A6 Hétéro-dimères/  Km et Vmax trifluopérazine N-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Fujiwara et al. 2007a) 1A9  Km et Vmax propofol-

O-G Expression hétérologue (HEK293)

(Fujiwara et al. 2007b) 2B7  Km et Vmax imipramine

N-G Expression hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010)

1A6

1A6 Homo-dimères Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) Co-ip (microsomes de foie humain) (Fremont et al. 2005; Fujiwara et al. 2007a) 1A1 Hétéro-dimères/ Vmax

sérotonine O-G et diclofénac O-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Fujiwara et al. 2007a) 1A4 Hétéro-dimères/ Vmax

sérotonine O-G et diclofénac O-G Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) (Fujiwara et al. 2007a) 1A9  Km et Vmax propofol-O-

Enzymes / Partenaires Données fonctionnelles Méthodes utilisées Références

(HEK293) al. 2007b) 2B7  Vmax sérotonine O-G Expression

hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010) 1A6

Y485D tous UGT1A et 2B  sérotonine-G Expression hétérologue/IMAC (Sf9)

(Kurkela et al. 2007)

1A9

1A9 Homo-dimères/ oligomères Expression

hétérologue/Gel natif (HEK293)

Chromatographie d‘affinité sur support solide (IMAC) (Sf9)

(Kurkela et al. 2003; Olson et al. 2009)

1A1  la stabilité thermique lorsque coexprimée avec 1A9/  Vmax estradiol 3- O-G Expression hétérologue (HEK293) (Fujiwara et al. 2007b)

1A4  la stabilité thermique lorsque coexprimée avec 1A9/  Km et Vmax imipramine-N-G Expression hétérologue (HEK293) (Fujiwara et al. 2007b)

1A4  Vmax (R)-4‘-HPPH O-G Expression hétérologue (HEK293)

(Nakajima et al. 2007) 1A6  la stabilité thermique

lorsque coexprimée avec 1A9/  Vmax sérotonine- O-G Expression hétérologue/Co-ip (HEK293) (Fujiwara et al. 2007b)

1A6  Vmax (S)-4‘-HPPH O-G

et (R)-4‘-HPPH O-G Expression hétérologue (HEK293)

(Nakajima et al. 2007) 2B7  Vmax Propofol O-G Expression

hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010) 1A9sol 1A4 Modifie ratio de

glucuronidation de l‘entacapone/scopolétine

Expression

hétérologue (Sf9) (Kurkela et al. 2004a)

2B7 2B7 Homo-dimères Expression hétérologue /Gel natif (HEK293) Co-ip (microsomes de foie humain) (Fremont et al. 2005; Fujiwara et al. 2010; Lewis et al. 2011)

1A1/6 Hétéro-oligomères Co-ip (microsomes

de foie humain) (Fremont et al. 2005) 1A1  Vmax zidovudine-G Expression

hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010) 1A4  Vmax zidovudine-G Expression (Fujiwara et

Enzymes / Partenaires Données fonctionnelles Méthodes utilisées Références

natif/Co-ip (HEK293) al. 2010) 1A6  Vmax et  Km zidovudine-G Expression hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293) (Fujiwara et al. 2010) 1A9  Vmax et  Km

zidovudine-G Expression hétérologue /Gel natif/Co-ip (HEK293)

(Fujiwara et al. 2010) 2B15/1A7/4 Hétéro-oligomères IP-MS (microsomes

de foie humain) (Fujiwara and Itoh 2013)

UGT- autres enzymes du métabolisme des médicaments

CYP3A4-UGT2B7/1A6/1 Hétéro-oligomères Co-ip (microsomes

de foie humain) (Fremont et al. 2005) CYP3A2/2C11/2B2/1A2-UGT

(rat)

Hétéro-oligomères Co-ip (microsomes de foie de rat)

(Ishii et al. 2007) CYP1A1-UGT

(rat) Hétéro-oligomères Chromatographie d‘affinité sur support solide (microsomes de foie de rat)

(Taura et al. 2000)

CYP3A4/2C9/1A2-UGT2B7  Vmax morphine 3-G Expression

hétérologue (Cos) (Takeda et al. 2005b) CYP3A4-UGT2B7  Km morphine 3-G Expression

hétérologue/Co- ip/Superposition (GST) (Cos) (Takeda et al. 2005a; Takeda et al. 2009) CYP3A4-UGT1A6  Km et Vmax 5-HT-G Expression

hétérologue (Sf9) (Ishii et al. 2014) CYP3A4-UGT1A1/7  Vmax SN-38-G Expression

hétérologue/

Superposition (GST) (Sf9)

(Ishii et al. 2014)

CYP3A4/1A2-UGT2B7 Hétéro-oligomères IP-MS (microsomes de foie humain)

(Fujiwara and Itoh 2013) GSTA2-UGT1A1 Hétéro-oligomères Co-ip (HEK293T) (Akizawa et

al. 2008) Sf9 : cellule d‘insecte; Cos/Cos-7 : cellule de rein de singe (Cercopithecus aethiops); HEK293/T : cellule de rein embryonnaire humain; co-ip : co-immunoprécipitation; 1A9sol : UGT1A9 dépourvue du domaine transmembranaire et queue C-terminale (délétion des acides aminés 483-530).

10 Objectifs, hypothèses de recherche,

méthodologies et importance des articles dans

la démarche scientifique

De nombreux processus cellulaires sont régulés par la formation de complexes d‘interactions protéiques, incluant de nombreuses voies métaboliques, des protéines du processus de l‘apoptose et du cycle cellulaire (Serrano et al. 1993; van Delft and Huang 2006; Wullschleger et al. 2006). Que ce soit via l‘homo- ou l‘hétéro-oligomérisation des protéines, les interactions protéiques confèrent également de nouvelles fonctions biologiques, altèrent parfois la localisation et influencent même la dégradation de certaines protéines (Karpa et al. 2000; von der Lehr et al. 2003). Ces modifications surviennent également de pair avec d‘autres processus post-traductionnels (ex. phosphorylation). Certaines études relatent également la capacité des enzymes UGT à interagir entre elles ainsi qu‘avec d‘autres protéines du métabolisme des médicaments, telles les CYP450. De plus, ces interactions protéine-protéine semblent influencer la capacité de glucuronidation ainsi que la spécificité de substrats de certaines enzymes UGT (Ikushiro et al. 1997; Meech and Mackenzie 1997b; Kurkela et al. 2004a; Fujiwara et al. 2007a; Fujiwara et al. 2007b; Kurkela et al. 2007; Nakajima et al. 2007; Operana and Tukey 2007; Fujiwara et al. 2010). Toutefois, peu d‘évidences provenant de l‘étude de tissus humains supportent l‘étendue de ce phénomène et son impact sur la fonction de glucuronidation tissulaire et cellulaire.

Notre laboratoire a démontré la présence d‘un exon terminal alternatif (5b) en 3‘ du locus UGT1A au niveau de la région contenant les exons communs à toutes les enzymes UGT1A. Ce nouvel exon code pour 10 acides aminés dont l‘identité est différente de celle des 99 acides aminés codés par l‘exon 5a classique. La présence de l‘exon 5b a également été démontrée au niveau de transcrits UGT d‘autres espèces, spécifiquement chez le rat et le singe, illustrant que ce processus d‘épissage alternatif soit conservé entre les espèces et suggérant un rôle biologique important (Girard et al. 2007; Levesque et al. 2007).

L‘inclusion de cet exon 5b entraîne la formation de 9 nouvelles isoformes plus courtes nommées i2. Ces nouvelles protéines alternatives s‘ajoutent aux 9 enzymes UGT1A déjà connues renommées i1. Les données publiées précédemment par notre groupe supportent l‘expression de transcrits et de protéines contenant la séquence de l‘exon 5b

dans une grande variété de tissus, particulièrement ceux impliqués dans le métabolisme des médicaments. Les protéines i2 présentent une expression variable d‘un tissu à l‘autre et entre les individus. Ces protéines alternatives sont également coexprimées avec les enzymes UGT1A dans plusieurs tissus humains. Les données démontrent également la colocalisation subcellulaire des i2 avec les enzymes UGT1A au niveau du RE. De plus, l‘enrichissement des protéines i2 dans les homogénats cellulaires, comparativement aux fractions microsomales, indique une localisation des isoformes alternatives i2 au cytosol (Levesque et al. 2007).

Les premières analyses fonctionnelles se sont jusqu‘à maintenant concentrées sur la surexpression de quelques protéines i2 seules ou coexprimées avec les enzymes UGT1A dans un modèle cellulaire (HEK293) étant dépourvu d‘activité UGT. Les conclusions de ces investigations révèlent que les protéines i2 sont dépourvues d‘activité transférase et diminuent de façon significative la glucuronidation de plusieurs substrats lorsque coexprimées avec les enzymes UGT1A. Une observation intéressante réside dans le niveau de répression de l‘activité de glucuronidation cellulaire par les protéines alternatives i2, qui semble comparable à celui de certains polymorphismes génétiques reconnus de la voie de glucuronidation comme ayant un effet significatif in vivo sur le métabolisme des médicaments (ex. UGT1A1*28) (Iyer et al. 2002). De plus, les données préliminaires de Lévesque et collaborateurs suggèrent que ce processus de répression soit médié par la formation de complexes d‘interactions protéiques entre les protéines i2 et les enzymes i1.

L‘hypothèse principale de mes travaux de doctorat stipule que les protéines alternatives dérivées du gène UGT1A modulent la glucuronidation cellulaire et puissent ainsi avoir un impact sur la réponse aux médicaments. La formation de complexes i1-i2 inactifs pourrait être responsable de l‘effet répresseur des protéines alternatives i2. Puisque les protéines i2 localisent également au niveau du cytosol, elles posséderaient d‘autres fonctions biologiques possiblement médiées par des interactions protéiques avec des partenaires autres que les enzymes UGT1A.

Mes travaux de doctorat avaient donc comme premier objectif de mieux caractériser la fonction des protéines i2 en étudiant leur effet répresseur sur les enzymes UGT. Puisque les tissus expriment des niveaux variables d‘UGT1A ainsi que diverses combinaisons des isoformes i1 et i2, nous avons par la suite étudié l‘effet de niveaux variables de protéines

i2 ainsi que leur potentiel d‘interaction avec diverses enzymes UGT1A. Suite à la production d‘anticorps permettant la reconnaissance de chacune des sous-classes de protéines UGT1A (i1 et i2), nous avons été en mesure d‘étudier de façon plus détaillée leur distribution tissulaire ainsi que leur expression dans les structures de divers tissus humains sains et cancéreux. Enfin, considérant la variabilité d‘expression des formes alternatives entre les individus, nous avons voulu établir des modèles permettant d‘étudier l‘influence de la variation des niveaux de protéines i2 tout en maintenant des niveaux constants d‘enzymes i1. Ces modèles ont permis de valider l‘effet modulateur des protéines i2 sur l‘activité de glucuronidation, et d‘en tester l‘impact sur la réponse pharmacologique à un agent anticancéreux. En terminant, nous avons élaboré une approche méthodologique permettant d‘établir l‘interactome endogène des protéines UGT1A dans les tissus humains contribuant au métabolisme des médicaments, avec pour objectif de révéler de nouvelles fonctions biologiques des formes alternatives i2.

10.1 Étudier le rôle modulateur des protéines i2 sur l’activité de