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Étude fonctionnelle des variants d'épissage des UGT1A humains

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Étude fonctionnelle des variants d’épissage des UGT1A

humains

Thèse

Mélanie Rouleau

Doctorat en Pharmacie

Philosophiae Doctor (Ph.D)

Québec, Canada

© Mélanie Rouleau, 2014

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Résumé

La réaction de glucuronidation prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases est une voie majeure du système de détoxification cellulaire qui influence la biodisponibilité de molécules endogènes et exogènes. Notre laboratoire a récemment découvert l‘existence de nouvelles protéines UGT nommées i2 dérivées de l‘épissage alternatif du gène UGT1A. Ces protéines sont dépourvues d‘activité transférase. Nous avons démontré par immunohistochimie que les enzymes i1 et les protéines alternatives i2 sont coexprimées dans plusieurs tissus du tractus gastro-intestinal, ainsi que dans les mêmes types cellulaires de ces tissus. Les i2 sont localisées dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE) avec les i1, mais sont également présentes dans le cytosol. Étant donné la proximité physique des i1 et i2 au RE, nous avons généré des modèles cellulaires surexprimant différentes combinaisons d‘enzymes i1 et de protéines i2. Nos données démontrent que la coexpression de ces deux types de protéines diminue l‘activité de glucuronidation de 20 à 80 % dépendamment du substrat et de l‘enzyme testés. Par co-immunoprécipitation, nous avons démontré que cette répression survient via l‘interaction physique des i1 avec les i2. À l‘inverse, l‘augmentation de l‘activité de glucuronidation suite à la répression des formes i2 endogènes a permis de confirmer ce rôle de modulateur négatif des i2. Il semble aussi que les i2 soient en mesure de moduler significativement l‘activité UGT même lorsque leur niveau d‘expression est inférieur à celui des i1, tel que retrouvé dans plusieurs tissus humains. Nos données supportent également l‘influence de ces protéines alternatives sur la réponse pharmacologique. En effet, la répression de l‘expression des i2 endogènes dans une lignée de cancer de côlon entraîne un avantage de survie sous traitement chimiothérapeutique. Enfin, l‘identification de l‘interactome tissulaire des isoformes des UGT1A démontre qu‘elles ont le potentiel d‘interagir avec des enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la migration cellulaire. Nos données supportent que les i2 ont même la capacité de modifier le potentiel migratoire de cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les i2 ont la capacité de moduler le stress oxydatif cellulaire, entre autres via l‘interaction avec des protéines antioxydantes, telle la catalase. En conclusion, nos résultats démontrent que les protéines alternatives i2 auraient le potentiel de moduler le système de défense cellulaire à plusieurs niveaux, en plus d‘influencer la réponse aux médicaments.

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Abstract

The glucuronidation reaction mediated by the UDP-glucuronosyltransferases (UGT) enzymes is a major pathway of cellular detoxification system and has a clear effect on xenobiotic and endobiotic bioavailability. We have recently discovered nine new UGT proteins, named i2, which are derived from UGT1A alternative splicing. Those proteins are devoid of transferase activity. Using immunohistochemistry, we have demonstrated that i1 enzymes and i2 alternative proteins are coexpressed in multiple tissues of the gastrointestinal tract and also in the same cell types. Alternative i2 are localized in the endoplasmic reticulum (ER) membrane along with i1, but are also detected in the cytosol. Given the physical proximity of i1 and i2 at the ER, we have generated cellular models overexpressing different combinations of enzymes and i2 alternative proteins. Our data revealed that coexpression of those two types of proteins leads to a decrease of 20 – 80 % of the glucuronidation activity depending on the substrate and enzyme tested. By co-immunoprecipitation experiments, we have demonstrated that this modulation occurs via the physical interaction of i1 and i2. We have confirmed the negative modulator function of i2 alternative proteins by RNA interference. Our results demonstrates that repression of endogenous i2 leads to a significant increase of cellular glucuronidation activity. Data also support the importance of expression ratio of i2 :i1. Indeed, even an expression of i2 below the level of i1, as found in several tissues, consistently resulted in a significant modulation of UGT activity. Our data also support the role of i2 alternative proteins on pharmacological response. Repression of endogenous i2 in a colon cancer cell line leads to an increased cell viability under chemotherapeutic treatment. Furthermore, identification of UGT1A endogenous interactome reveals their capacity to physically interact with protein implicated in energy metabolism and cell migration. Our data support that i2 alternative proteins have the capacity to modulate migration potential of cancer cells. We have also demonstrated that i2 alternative proteins are able to modulate cellular oxidative stress, in part via protein-protein interaction with anti-oxidant proteins, such as catalase. In conclusion, our results demontrate that i2 alternative proteins have the potential to modulate the cellular defense system at multiple levels in addition to influence pharmacological response.

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Table des matières

Résumé ... iii

Abstract ... v

Table des matières ... vii

Liste des tableaux ... xi

Liste des figures ... xiii

Liste des abréviations et des sigles ... xv

Remerciements ... xxi

Avant-propos ... xxv

Introduction ... 1

1 Réaction de glucuronidation ... 1

2 Nomenclature de la famille des UGT ... 3

2.1 UGT1 ... 4

2.2 UGT2 ... 5

3 Structure protéique ... 5

4 Fonctions des UGT ... 7

5 Expression tissulaire ... 9

6 Régulation de la voie de glucuronidation... 11

6.1 Régulation au niveau génomique/transcriptomique ... 11

7 Épissage alternatif de l‘ARN pré-messager ... 15

7.1 Concepts généraux ... 15

7.2 Impact de l‘épissage alternatif sur la fonction protéique ... 19

7.3 Dérèglements de l‘épissage alternatif ... 23

7.3.1 Mutations en cis ... 24

7.3.2 Modifications des facteurs de régulation en trans ... 24

7.3.3 Impact de l‘épissage alternatif sur la réponse pharmacologique ... 25

8 Évènements d‘épissage alternatifs pour les UGT ... 27

8.1 UGT2B28 ... 27

8.2 UGT1 ... 27

8.3 UGT2A ... 33

8.4 UGT2B4 ... 34

8.5 UGT2B7 ... 36

9 Régulation de l‘activité enzymatique au niveau protéique ... 38

9.1 Modifications post-traductionnelles ... 39

9.1.1 Clivage du peptide signal ... 39

9.1.2 Modification de l‘activité enzymatique et de la spécificité de substrat par la phosphorylation ... 39

9.1.3 Glycosylation ... 40

9.2 Interactions protéiques ... 41

9.2.1 Rôles des interactions protéiques sur les processus cellulaires ... 41

9.2.2 Approches expérimentales favorisées pour l‘identification et la caractérisation des interactions protéiques... 42

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10 Objectifs, hypothèses de recherche, méthodologies et importance des articles dans la

démarche scientifique ... 55

10.1 Étudier le rôle modulateur des protéines i2 sur l‘activité de glucuronidation cellulaire ... 57

10.2 Évaluer le potentiel d‘interaction entre les diverses protéines alternatives i2 et les enzymes UGT1A ... 59

10.3 Évaluer l‘implication de divers domaines protéiques des enzymes UGT dans l‘interaction entre les isoformes i1 et i2 ... 60

10.4 Étudier la distribution tissulaire des isoformes i1 et i2 dans les tissus humains ... 62

10.5 Étudier l‘influence de la variation du niveau d‘expression des isoformes i2 sur l‘activité de glucuronidation ... 63

10.6 Étudier l‘influence de la modulation de l‘expression endogène des protéines alternatives i2 sur l‘activité de glucuronidation cellulaire ... 64

10.7 Étudier l‘influence de la modulation de l‘expression endogène des protéines alternatives i2 sur la réponse pharmacologique à un agent anticancéreux ... 66

10.8 Identifier l‘interactome endogène des protéines alternatives i2 et des enzymes UGT1A par une approche protéomique non ciblée ... 68

Chapitre II... 71

Étudier le rôle modulateur des protéines i2 sur l‘activité de glucuronidation cellulaire ... 71

Chapitre III ... 99

Évaluer le potentiel d‘interaction entre les diverses protéines alternatives i2 et les enzymes UGT1A ... 99

Chapitre IV ... 125

Évaluer l‘implication de divers domaines protéiques des enzymes UGT dans l‘interaction des isoformes i1 et i2 ... 125

Chapitre V ... 155

Étudier la distribution tissulaire des isoformes i1 et i2 dans les tissus humains ... 155

Chapitre VI ... 187

Étudier l‘influence de la variation du niveau d‘expression des isoformes i2 sur l‘activité de glucuronidation ... 187

Chapitre VII ... 205

Étudier l‘influence de la modulation de l‘expression endogène des protéines alternatives i2 sur l‘activité de glucuronidation cellulaire ... 205

Chapitre VIII ... 239

Étudier l‘influence de la modulation de l‘expression endogène des protéines alternatives i2 sur la réponse pharmacologique à un agent anticancéreux ... 239

Chapitre IX ... 283

Identifier l‘interactome endogène des protéines alternatives i2 et des enzymes UGT1A par une approche protéomique non ciblée ... 283

Discussion ... 331

Section A : Discussion des données générées lors de l‘étude du rôle des isoformes i2 dans la modulation de l‘activité de glucuronidation cellulaire ... 331

Section B : Discussion des données concernant l‘évaluation de la modulation de la réponse aux médicaments par les protéines régulatrices i2 ... 346

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Section C : Discussion des données concernant l‘identification de l‘interactome des protéines UGT1A ... 348 Conclusion ... 353 Bibliographie ... 355

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Liste des tableaux

Tableau 1. Facteurs de transcription influençant l‘expression des gènes UGT. ... 12 Tableau 2. Quelques exemples de l'impact de l'épissage alternatif sur la fonction protéique ... 21 Tableau 3. Exemples de mutations affectant l‘épissage alternatif (EA) liées à des

pathologies humaines. ... 23 Tableau 4. Exemples d‘évènements d‘épissage alternatifs qui affectent la réponse

pharmacologique. ... 26 Tableau 5. Conséquences des interactions protéine-protéine pour p53 ... 42 Tableau 6. Méthodes expérimentales utilisées pour l'étude des interactions

protéine-protéine. ... 43 Tableau 7. Oligomérisation des protéines UGT et leur impact fonctionnel. ... 50

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Liste des figures

Figure 1. Représentation schématique de la réaction de glucuronidation. ... 2 Figure 2. Localisation et organisation génomique des locus UGT1 et UGT2 humains. ... 4 Figure 3. Représentation schématique de la protéine UGT1A9 et de ses domaines

protéiques. ... 6 Figure 4. Proportion des molécules pharmacologiques métabolisées par chacune des

classes d'enzymes de phase I et II. ... 8 Figure 5. Distribution tissulaire des UGT1A et 2B humains dans les organes impliqués

dans le métabolisme des médicaments. ... 10 Figure 6. Illustration schématique de divers évènements d'épissage alternatifs. ... 16 Figure 7. Reconnaissance des sites d'épissage et réactions de transestérification de

l'épissage des introns. ... 18 Figure 8. Nouvel évènement d'épissage alternatif au locus UGT1A. ... 28 Figure 9. Représentation schématique du gène UGT1A et des évènements d'épissage

alternatifs en 5' et en 3' de ce locus. ... 29 Figure 10. Représentation schématique des protéines UGT1A isoformes 1 et isoformes 2.

... 31 Figure 11. Distribution tissulaire des formes d'épissage d'UGT1A humain. ... 32 Figure 12. Représentation schématique de la structure primaire des isoformes dérivées de l'épissage alternatif d'UGT2B4. ... 35 Figure 13. Évènements d'épissage alternatifs au locus UGT2B7. ... 38 Figure 14. Schématisation de la technique de résonance de plasmons de surface. ... 334 Figure 15. Représentation schématique des interactions protéiques suite à la délétion du

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Liste des abréviations et des sigles

aa Acide aminé

ADH Alcool déshydrogénase

ADN Acide désoxyribonucléique

ADNc ADN complémentaire

AhR « Aryl hydrocarbon receptor »

AIMP2 « ARS-interacting multifunctional protein 2 »

ALDH Aldéhyde déshydrogénase

AR Récepteur aux androgènes

ARN Acide ribonucléique

ARNi ARN interférent

ARNm ARN messager

ASF/SF2 « Serine/arginine-rich splicing factor 1 »

ATP Adénosine triphosphate

BaP Benzo-α-pyrène

bHLH-PAS « basic-helix-loop-helix/Per-ARNT-Sim »

BIM « Bcl-2-like protein »

BME β-mercaptoéthanol

BRAF « Serine/threonine-protein kinase B-raf » BRCA1 « Breast Cancer 1, Early Onset »

BRET « Bioluminescence resonance energy transfer »

bZIP « basic leucine zipper »

CAR « Constitutive androstane receptor »

CAT Catalase

CCN2 « Connective tissue growth factor »

CFLAR « CASP8 and FADD-like apoptosis regulator »

CHEK2 « Checkpoint kinase 2 »

CML « Chronic myeloid leukemia » ou leucémie myéloïde chronique

CNV « copy number variation »

Co-IP Co-immunoprécipitation

COMT Catéchol O-méthyltransférase

CPT-11 7-éthyl-10-[4-( 1 -piperidino)-1 -piperidinoj-carbonyloxy camptothécine

CYP Cytochrome P450

DBD « DNA binding domain » ou domaine de liaison à l‘ADN

del Délétion

DHT Dihydrotestostérone

DPD Dihydropyrimidine déshydrogénase

ERα « Estrogen receptor alpha »

ESE « Exonic splicing enhancer »

ESS « Exonic splicing silencer »

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FosB « FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B » FRET « Förster resonance energy transfer »

FXR « Farnesoid X receptor »

GFP « Green fluorescent protein » ou protéine verte fluorescente

GH-1 « Growth hormone 1 »

GST Glutathione S-transférase

HMGCR « 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-2 »

HMT Histamine méthyltransférase

HNF1α « Hepatocyte nuclear factor 1-alpha » HNF4α « Hepatocyte nuclear factor 4-alpha »

hnRNP « Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins »

HPRP3 Pre-mRNA processing factor 3

HSPA5 « 78 kDa glucose-regulated protein » i1 et i2 Isoforme protéique 1 et 2

IHC Immunohistochimie

IP Immunoprécipitation

ISE « Intronic splicing enhancer » ISS « Intronic splicing silencer »

KD « Knockdown »

LRRK2 « Leucine-rich repeat kinase 2 »

LXR « Liver X receptor »

MDM2 « E3 ubiquitin-protein ligase Mdm2 » MDR1 « Multidrug resistance protein 1 »

miARN Micro-ARN

MLCK « Myosin light chain kinase »

MMF Mycophénolate mofétil

MPA Acide mycophénolique

MRA « Micro-region anchoring » ou microrégion d‘ancrage

MS Spectrométrie de masse

NAT N-acétyltransférase

NMD « Non-mediated decay »

NQO1 NADPH:quinone oxydoréductase

NR « Nuclear receptor »

NRF2 « Nuclear factor erythroid 2-related factor 2 »

NSCLC « Non small cell lung cancer » ou cancer du poumon non à petites cellules

Pbx2 « Pre-B-cell leukemia transcription factor 2 »

PCR « Polymerase chain reaction » ou réaction en chaîne de la polymérase

PhIP Amino-1-méthyl-6-phénylimidazo[4,5-b]pyridine

pI Point isoélectrique

PKC Protéine kinase C

PP1 « Protein phosphatase 1 »

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Prdx1 Peroxiredoxine 1

PTM « Post-translational modification » ou modification post-traductionnelle

PXR « Pregnane X receptor »

RE Réticulum endoplasmique

ROS « Reactive oxygen species » ou dérivés réactifs de l‘oxygène SAINT « Statistical Analysis of INTeractome »

SDS-PAGE « Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis »

SF « Splicing factor »

shARN « Short hairpin RNA » ou ARN en forme d‘épingle à cheveux siARN « Small interfering RNA » ou petit ARN interférent

SILAC « Stable Isotope Labeling of Amino Acids in Cell Culture » SLC35D1 « Solute Carrier Family 35 (UDP-Glucuronic

Acid/UDP-N-Acetylgalactosamine dual Transporter), Member D1 » SMN « Survival of motor neuron 1, telomeric »

SN-38 7-éthyl-10-hydroxy-camptothécine snRNP « Small ribonuclear protein »

SPR « Surface plasmon resonance » ou résonance de plasmons de surface

SR « Serine/arginine rich »

ST Sulfotransférases

TAM Tamoxifen

TAP « Tandem affinity purification » TCDD « 2,3,7,8-tetrachlorodibenzodioxin »

TMD « Transmembrane domain » ou domaine transmembranaire

TPMT Thiopurine méthyltransférase

U2AF « U2 auxiliary factor »

UDP Uridine diphosphate

UDPGlcA Acide diphospho glucuronique

UGT Uridine diphospho-glucuronosyltransférase UTR « Untranslated region » ou région non traduite v1 / v2 /v3 Variant d‘ARNm 1, 2, 3

WT1 « Wilms tumor 1 »

XRE « Xenobiotic response element » ou élément de réponse aux xénobiotiques

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« If I cannot do great things, I can do small

things in a great way » - Martin Luther King

Jr.

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Remerciements

Je tiens tout d‘abord à remercier les évaluateurs de ma thèse, soit le Dr Benoît Drolet, Dr Éric Lévesque et Dr Sylvie Fournel-Gigleux. Merci beaucoup pour votre temps.

Je tiens également à remercier ma directrice de doctorat, Dr Chantal Guillemette. Merci de m‘avoir accueillie dans votre laboratoire il y a de cela plus de 6 ans déjà (stage de recherche, maîtrise, doctorat). Merci de m‘avoir donné la chance de travailler sur des projets toujours aussi passionnants. J‘ai toujours été très fière d‘aller représenter votre laboratoire dans les congrès nationaux et internationaux. Merci d‘avoir cru en mon potentiel et de m‘avoir donné tous les outils nécessaires pour le développer tout au long de ces années.

Merci aux nombreux membres de l‘équipe du labo CG. Lyne, le petit rayon de soleil, merci pour ton écoute, ta compréhension et tes conseils. C‘est toute une chance de t‘avoir dans le labo avec nous, j‘espère que tu le sais! Lâche pas la course, on fait un 10km ensemble l‘an prochain  ? Merci à Judith, celle qui m‘a guidée dans le laboratoire sur son projet de doctorat. Ta passion a été contagieuse. Merci de ta patience, d‘avoir pris le temps de partager ton savoir, de m‘avoir intégrée à l‘équipe et à vos activités, je t‘en suis très reconnaissante! Merci à Isa (L), d‘avoir partagé tous ces moments, traverser toutes ces étapes avec toi fût très agréable. Ta présence, tes anecdotes, ton savoir ont embelli mon passage au labo. Au plaisir de retravailler avec toi! Les petits derniers du labo : nos Français Anais, Alan et Guillaume, qui nous font ouvrir nos horizons et constater à quel point on en dit des anglicismes! Ce fût très agréable de vous côtoyer, de vous voir évoluer. Au plaisir de rejouer au soccer, de courir, de manger une poutine ou de prendre une bière avec vous! Merci à Yannick, de ta patience et de ta débrouillardise. J‘espère que tu auras autant de plaisir sur ce projet que j‘en ai eu dans les 6 dernières années. Merci à Sylvia, de nous avoir divertis et permis d‘améliorer notre anglais. Ton français s‘améliore énormément, lâche pas! Merci à Andréa, pour ta bonne humeur et les discussions de voyage, de rénos, toujours aussi divertissantes! T‘es une vraie machine des cellules! Un gros merci à Michèle, pour tes conseils et ton écoute. Malgré le peu de temps que nous avons travaillé ensemble, ton aide fût indispensable. Merci de m‘avoir aidée dans mes nombreux questionnements scientifiques et professionnels. Tu représentes un atout incroyable pour le laboratoire. Merci à Pat et Véro, pour leur disponibilité et leur patience. Toujours prêts à répondre à nos questions! Merci aux anciens membres du labo CG :

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Mario, pour tes connaissances scientifiques incroyables, ton écoute et ton humour! À quand la prochaine saison d‘OD question de potiner un peu! Merci à Pierre, pour son aide et sa patience sur le projet. Bonne chance dans tes études de doctorat! Merci à Étienne et Vincent, toujours agréable de discuter science avec vous! J‘ai pu personne pour rire des citations de François Pérusse maintenant! Merci à Cricri, Oli : le petit bout de chemin qu‘on a parcouru ensemble fût très agréable. Merci à Sarah-Ann, qui fût une excellente stagiaire. Très organisée, super sympathique, on aurait bien aimé te garder plus longtemps! Bonne chance dans ta future carrière de chiro! Merci à Isa (G), pour ton aide et ta bonne humeur! Même après autant de temps en culture cellulaire, c‘était toujours aussi agréable, jour après jour, d‘y retourner et de travailler avec toi! Un merci tout spécial à Joannie. Quelle « team » on a fait! Ça m‘a pris un peu de temps à comprendre ton humour, mais mon dieu qu‘on a eu du plaisir à faire avancer ce beau projet! Merci d‘avoir organisé toutes ces belles activités, et surtout de continuer de le faire! Au plaisir de te revoir bientôt!

Merci au Dr Olivier Barbier ainsi qu‘aux membres de son équipe. Toujours prêts à collaborer, à nous dépanner, à discuter des projets, une telle collaboration inter-équipe est une ressource très importante. Merci à Mel (V), pour son écoute, sa motivation à me faire courir encore plus (t‘es vraiment une machine!). Merci à Joce pour ses blagues toujours bien placées! Merci aux anciens membres, Laurent, Martin, Sophie : votre présence au labo a été très divertissante, ce fût un plaisir de vous côtoyer! Merci également aux membres des autres équipes : Simon, Karine, Mel Pel. Merci à Simon pour ses blagues incroyables, tu es une source inépuisable de divertissement! Karine, alias Speedy Gonzalez, merci de m‘avoir accompagnée pour la course le midi. N‘hésite pas si t‘as des questions de coIP! Merci à Mel Pel, pour ton aide et nos discussions! Peu importe le sujet, ça a toujours été plaisant de discuter avec toi! Merci également au personnel de la plateforme de protéomique et de bio-informatique, Sylvie, Isabelle, Benjamin, Daniel, Frédéric, pour votre générosité, votre professionnalisme et votre patience envers mes nombreuses questions.

Merci à mes amies, Clau et Stef, d‘avoir été si compréhensives, pour mes horaires pas possibles, et de m‘avoir épaulé pendant toutes ces années. On est reparties pour un autre 25 ans ensemble les filles! Merci à Sam et Cass, pour tous ces beaux moments, ces conseils indispensables, votre écoute et votre compréhension. Je suis tellement

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terme convient tellement bien! Merci de m‘avoir supportée tout au long de ces années, et aussi pour tous ces beaux moments que nous partageons ensemble! Merci à mes parents, de m‘avoir toujours soutenue, autant dans la vie que dans mes études. Là c‘est vrai, c‘est la fin! On ne choisit pas notre famille, mais une chose est sûre, si j‘avais dû choisir la mienne, je vous aurais pris sans aucun doute! Vous êtes tellement beaux après toutes ces années, vous êtes une source d‘inspiration pour moi! Je vous aime tellement!

Finalement, merci à mon homme, mon confident, mon meilleur ami, Vince. Depuis toutes ces années, tu as été là, à me soutenir, m‘encourager, m‘écouter. Ta patience est enfin récompensée après 12 ans, fini les études! Je suis tellement chanceuse de t‘avoir à mes côtés et j‘ai tellement hâte de relever de nouveaux défis à tes côtés, car je sais qu‘avec toi, je suis forte. Je t‘aime.

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Avant-propos

La présente thèse intitulée « Étude fonctionnelle des variants d‘épissage des UGT1A humains », présentée à la Faculté des études supérieures et postdoctorales de l‘Université Laval pour l‘obtention du grade de Philosophiae doctor, est rédigée sous la forme d‘insertion d‘articles.

Le premier article intitulé « The Modulation of the Human Glucuronosyltransferase UGT1A Pathway by Splice Isoform Polypeptides is Mediated Through Protein-Protein Interactions » (Bellemare et al. 2010b), duquel je suis deuxième auteure, a été publié dans la revue « The Journal of Biological Chemistry » en février 2010. J‘ai réalisé la quantification de l‘expression des UGT dans certaines lignées par immunobuvardage, ainsi qu‘une partie des essais enzymatiques. J‘ai contribué à environ 20-25 % de la réalisation de cette étude. L‘auteure principale, Judith Bellemare, a produit les nouvelles lignées cellulaires exprimant stablement et/ou sous contrôle inductible les différents UGT à l'étude. Elle a également effectué des expériences d'immunobuvardage et essais enzymatiques, de même que le calcul des affinités, vélocités, clairances et analyses statistiques de chacune des lignées cellulaires testées. Elle a mis au point le protocole de co-immunoprécipitaion et testé les interactions entre les différentes isoformes, incluant les étapes de culture cellulaire et transfections transitoires. Mario Harvey a participé à l'analyse des données, ainsi qu'à la rédaction et la révision de l'article. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le deuxième article intitulé « Alternatively Spliced Products of the UGT1A Gene Interact with the Enzymatically Active Proteins to Inhibit Glucuronosyltransferase Activity In Vitro » (Bellemare et al. 2010a), duquel je suis deuxième auteure, a été publié dans la revue « Drug Metabolism and Disposition » en octobre 2010. Mon rôle dans cette étude a été d‘effectuer les expériences de co-immunoprécipitation et j‘ai participé à la réalisation des essais enzymatiques. J‘ai contribué à environ 25 % de la réalisation de cette étude. L‘auteure principale, Judith Bellemare, a généré des nouvelles lignées cellulaires, quantifié leur niveau d'expression par immunobuvardage et effectué des essais enzymatiques, de même que le calcul des affinités, vélocités, clairances et analyses statistiques de chacune des lignées cellulaires testées. Elle a effectué les étapes de culture cellulaire et de

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transfections transitoires en vue des expériences de co-immunoprécipitation. Elle a également écrit la version initiale de ce manuscrit et préparé les figures et tables. Mario Harvey a participé à l'analyse des données et à la révision de l'article. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le troisième article intitulé « Protein-Protein Interactions Between the Bilirubin-Conjugating UDP-Glucuronosyltransferase UGT1A1 and its Shorter Isoform 2 Regulatory Partner Derived from Alternative Splicing » (Rouleau et al. 2013a), duquel je suis l‘auteure principale, a été publié dans la revue « The Biochemical Journal » en février 2013. Dans cette étude, j‘ai participé aux expériences de mutagénèses dirigées par PCR et au clonage des différentes protéines tronquées avec l‘aide de Pierre Collin. J‘ai réalisé les immunobuvardages en conditions non réductrices, ainsi que les expériences de localisation subcellulaire. Pierre Collin a également participé à la transfection des différents plasmides, ainsi qu‘aux expériences de co-immunoprécipitation. J‘ai contribué à environ 75 % des résultats obtenus dans cette étude. J‘ai également écrit la version initiale du manuscrit et préparé les tables et figures. Mario Harvey a participé à l‘analyse des résultats et à la révision de l‘article. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le quatrième article intitulé « Immunohistochemical Expression of Conjugating UGT1A-Derived Isoforms in Normal and Tumoral Drug-Metabolizing Tissues in Humans » (Bellemare et al. 2011), duquel je suis deuxième auteure, a été publié dans la revue « Journal of Pathology » en février 2011. Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Dr Bernard Têtu qui nous a fourni les échantillons de tissus humains. J‘ai effectué les expériences d'immunohistochimie avec Judith Bellemare. Pour ce manuscrit, j'ai contribué à environ 15 % des résultats obtenus. L‘auteure principale, Judith Bellemare, a effectué les analyses microscopiques en collaboration avec le Dr Georges Pelletier. En parallèle, les échantillons ont été également analysés par Ion Popa, résident en pathologie avec le Dr Bernard Têtu. Judith Bellemare a écrit la version initiale de ce manuscrit et préparé les figures. Mario Harvey a participé à la révision de l'article. Ma directrice de recherche,

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l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le cinquième article intitulé « The Relative Protein Abundance of UGT1A Alternative Splice Variants as a Key Determinant of Glucuronidation Activity In Vitro » (Rouleau et al. 2013b), duquel je suis l‘auteure principale, a été publié dans la revue « Drug Metabolism and Disposition » en avril 2013. Dans cette étude, j‘ai effectué la transfection, la sélection et l‘isolement des 23 lignées clonales avec l‘aide de Joannie Roberge et Lyne Villeneuve. Sarah-Ann Falardeau a effectué la préparation des fractions microsomales, réalisé les essais enzymatiques et l‘étude de l‘expression des UGT par immunobuvardage. J‘ai également réalisé les expériences de co-immunoprécipitation, participé à l‘analyse des résultats, à la rédaction du manuscrit et à la préparation des figures. J‘ai contribué à environ 75 % de cette étude. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le sixième article intitulé « Alternative-Splicing Forms of the Major Phase II Conjugating UGT1A Gene Negatively Regulate Glucuronidation in Human Carcinoma Cell Lines » (Bellemare et al. 2010c), duquel je suis la deuxième auteure, a été publié dans la revue « The Pharmacogenomic Journal » en décembre 2009. Cette étude a été réalisée en collaboration avec le Dr Bernard Têtu qui a rendu disponible des échantillons de tissus de côlons humains. J‘ai participé à la caractérisation de l'expression des différentes isoformes d'UGT présentes dans les 2 lignées cellulaires étudiées par PCR (figure supplémentaire du manuscrit), en plus d‘assister Judith Bellemare lors des différents essais enzymatiques effectués. L‘auteure principale Judith Bellemare a caractérisé le nouvel anticorps spécifique aux variants d'épissage isoformes 2, effectué les expériences d'immunohistochimie, ainsi que les marquages en immunofluorescence. Elle a effectué la culture cellulaire et réalisé les analyses de quantification des UGT, ainsi que les essais enzymatiques sur les différents échantillons. Pour ce manuscrit, j'ai contribué à environ 25 % des résultats obtenus. Judith Bellemare a écrit la version initiale de ce manuscrit et préparé les figures. Mario Harvey a participé à l'analyse des données ainsi qu'à la révision de l'article. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

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Le septième article intitulé « Dual Roles for Splice Variants of the Glucuronidation Pathway as Regulators of Cellular Metabolism », duquel je suis l‘auteure principale, a été publié dans la revue « Molecular Pharmacology » en janvier 2014. J‘ai participé à la réalisation des expériences de cytométrie en flux pour l‘étude du stress oxydatif, en plus d‘établir le marquage par isotope stable des lignées cellulaires pour l‘identification de la variation d‘expression protéique. J‘ai également effectué les expériences de purification d‘affinité des complexes d‘interactions protéiques, en plus de confirmer les interactions protéine-protéine par des expériences de co-immunoprécipitation. Joannie Roberge a réalisé les expériences d‘interférence à l‘ARN par la production des lentivirus et l‘infection de la lignée HT115. Elle a également réalisé les expériences de viabilité cellulaire, une analyse de l‘expression génique par puce à ADN et participé à la rédaction de la version initiale du manuscrit. J‘ai participé à la confirmation des variations d‘expression identifiées par puce à ADN et protéomique à l‘aide de PCR quantitatif et immunobuvardage, en plus de l‘évaluation de l‘activité catalase avec l‘aide de Joannie Roberge. Judith Bellemare a participé à l‘élaboration de la stratégie d‘interférence à l‘ARN et à la conception de l‘étude. J‘ai contribué à environ 55 % des résultats obtenus pour cette étude. J‘ai contribué à la rédaction du manuscrit et préparé les tables et figures. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette, a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit. L'article inséré dans cette thèse est identique à la version publiée.

Le huitième article intitulé « Untargeted Proteomics Analysis of UGT1A Network in Human Drug Metabolizing Tissues», duquel je suis l‘auteure principale, est en préparation pour soumission à la revue « Molecular and Cellular Proteomics ». Dans cette étude, j‘ai réalisé les expériences de purification d‘affinité dans les fractions tissulaires, les analyses in silico et confirmé l‘immunoprécipitation de nos protéines d‘intérêt par immunobuvardage. Pierre Collin a participé à l‘étude des résultats bruts de spectrométrie de masse, en plus de réaliser des expériences de co-immunoprécipitation. Avec l‘aide de Michèle Rouleau, nous avons conçu une base de données complète des protéines UGT, analysé les résultats de spectrométrie de masse et rédigé le manuscrit. Yannick Audet-Delage a réalisé les expériences de co-immunoprécipitation afin de confirmer les interactions protéiques. J‘ai réalisé la culture cellulaire nécessaire aux expériences de co-immunoprécipitation. J‘ai participé à environ 75 % de cette étude. Ma directrice de recherche, Chantal Guillemette,

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a conceptualisé et supervisé l'étude, effectué l'analyse et l'interprétation des résultats, la rédaction et la révision du manuscrit.

Cette thèse comprend une introduction où je présente les différents thèmes étudiés durant mes travaux de doctorat. La revue de littérature est suivie de huit articles rédigés en anglais et chacun précédé d‘un résumé en français, présentés dans des chapitres distincts. Les articles insérés dans cette thèse sont tous structurés comme suit : résumé, introduction, matériel et méthodes, résultats, discussion, bibliographie, tableaux et figures. Ces chapitres sont ensuite suivis d‘une discussion des résultats obtenus ainsi que d‘une conclusion et perspective de recherche. Une liste des références citées dans l‘introduction et la discussion termine cette thèse.

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Introduction

L‘épissage alternatif est un processus qui survient pour plus de 90% des gènes humains, contribuant ainsi de façon notable à la diversité protéique provenant d‘un nombre de gènes limité (Pan et al. 2008; Barash et al. 2010; Kornblihtt et al. 2013). Ce processus cotranscriptionnel possède diverses fonctions, et permet notamment de générer plusieurs transcrits aux fonctions potentiellement variées à partir d‘un seul locus, en plus de moduler l‘expression génique d‘un variant aux dépens d‘un autre (Stamm et al. 2005; Berge et al. 2010; Pimentel et al. 2014). L‘épissage alternatif est un mécanisme conservé entre les espèces, allant de la drosophile à l‘humain, suggérant ainsi son importance tout au cours de l‘évolution (Copley 2004; Kim et al. 2004). La régulation de ce mécanisme s‘effectue également à plusieurs niveaux, que ce soit par l‘expression différentielle de protéines agissant en trans ou par la reconnaissance de séquences spécifiques (facteurs cis) (Chen and Manley 2009).

Le locus UGT1A n‘échappe pas à la régulation de son expression par l‘épissage alternatif. En effet, au moment d‘initier ces études, il était connu que des promoteurs alternatifs et des évènements d‘épissage alternatifs en 5‘ du locus augmentent la diversité protéique, l‘expression tissu-spécifique et l‘étendue des substrats reconnus par cette famille de protéines impliquées dans la détoxification de nombreuses molécules (Gong et al. 2001). Des données publiées par notre laboratoire en 2007 ont démontré la présence d‘un nouvel évènement d‘épissage alternatif impliquant un exon supplémentaire en 3‘ du gène UGT1A. Ce mécanisme permet également d‘augmenter la diversité protéique encodée par ce locus (Girard et al. 2007; Levesque et al. 2007). Mes travaux de doctorat avaient pour objectif d‘étudier la fonction de ces nouvelles protéines dérivées de l‘épissage alternatif du gène UGT1A.

1 Réaction de glucuronidation

Chez les mammifères, les gènes de la superfamille des uridine diphosphate (UDP)-glucuronosyltransférases (UGT) encodent pour des enzymes qui catalysent la réaction de glucuronidation. Cette réaction consiste au transfert covalent d‘un groupement acide glucuronique, à partir du cosubstrat acide uridine 5‘-diphospho-α-D-glucuronique (UDPGlcA) sur différents groupements fonctionnels (hydroxyle, carboxyle, amine, sulfure, etc.) de petites molécules lipophiles (aglycones) (Radominska-Pandya et al. 1999) (Figure

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1). Les glucuronides (acide β-D-glucopyranosiduronique) formés sont ainsi plus polaires, facilitant leur excrétion dans la bile et l‘urine (Radominska-Pandya et al. 1999). Une grande variété de composés, incluant des substrats de provenance endogène et exogène, est glucuronidée par les enzymes UGT. Dans la majorité des cas, la réaction de glucuronidation entraîne l‘inactivation du substrat, à l‘exception de certaines molécules telles la morphine et les acides rétinoïques (Formelli et al. 1996; Coffman et al. 1998).

Les types de glucuronides les plus fréquemment retrouvés sont : i) les éthers O-glucuronides, formés à partir de substrats comprenant des groupements phénols et alcools, et ii) les esters O-glucuronides, formés à partir de substrats comprenant des groupements acides carboxyliques (Dutton 1980). La glucuronidation des amines mène à la formation de N-glucuronides, alors que la glucuronidation de groupements sulfhydriles entraîne la formation de S-glucuronides (Dutton 1980).

La capacité des UGT à cibler une grande diversité de groupements fonctionnels, couramment retrouvés sur de nombreuses molécules endogènes et exogènes, supporte le rôle primordial de cette voie de biotransformation. Quelques données suggèrent également que les enzymes UGT ont le potentiel d‘utiliser d‘autres cosubstrats, tels l‘UDP-glucose et l‘UDP-xylose (Senafi et al. 1994; Chen et al. 2003; Mackenzie et al. 2003a). Par contre, le rôle et la pertinence clinique de ces réactions de glycosidation par les UDP-glucuronosyltransférases restent à être élucidés.

Figure 1. Représentation schématique de la réaction de glucuronidation.

Les UGT sont des enzymes impliquées dans l‘inactivation et l‘élimination de plusieurs substances nucléophiles. Les UGT conjuguent des molécules endogènes et exogènes.

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Cette réaction implique le transfert d‘un groupement acide glucuronique à partir du cosubstrat UDPGlcA sur plusieurs groupements chimiques de molécules hydrophobes. Plus spécifiquement, la réaction implique deux substitutions nucléophiliques, appelée SN2.

Le substrat nucléophilique accepteur est activé par déprotonation par un résidu basique, qui peut, par la suite, attaquer le carbone 1 de l‘acide glucuronique. De façon concomitante, il y a formation d‘un lien β-glycosidique et le relâchement de l‘UDP (Radominska-Pandya et al. 2005). Figure adaptée de Guillemette 2003.

La réaction de glucuronidation est caractérisée par une latence (intervalle de temps où la glucuronidation n‘est pas débutée), résultant en partie de la localisation majoritaire de la protéine à la surface luminale de la membrane du RE (Bossuyt and Blanckaert 1997; Meech and Mackenzie 1997a). Le cosubstrat et le substrat doivent ainsi traverser la membrane hydrophobe afin de prendre part à la réaction de glucuronidation. Le transport de l‘UDPGlcA du cytosol vers le RE est majoritairement pris en charge par le transporteur SLC35D1 (Muraoka et al. 2001).

2 Nomenclature de la famille des UGT

Les gènes UGT ont été classifiés en deux grandes familles, soit les UGT1 et UGT2. Plus de la moitié des enzymes UGT humaines découlent de la famille UGT1 (Figure 2). La diversité protéique générée par les gènes UGT nécessite une nomenclature particulière afin d‘assurer une cohérence entre les études. Ainsi, les enzymes de la superfamille UGT sont nommées selon leur évolution divergente. Chacun des gènes est nommé par l‘acronyme UGT suivi d‘un chiffre arabe représentant la famille, une lettre qui indique la sous-famille et finalement un chiffre arabe pour chaque gène individuel de cette famille ou sous-famille (Mackenzie et al. 2005a). La similarité de séquence protéique entre les différents UGT s‘élève à 41 % (Burchell et al. 1991; Tukey and Strassburg 2000; Mackenzie et al. 2005a), alors qu‘elle est de 66 % entre les membres d‘UGT1A et de 59 % pour la famille UGT2 (Tukey and Strassburg 2000; Gong et al. 2001). Plus spécifiquement, la similarité est de 78 % entre les UGT2B et d‘environ 70 % pour les UGT2A (Tukey and Strassburg 2000; Bushey et al. 2013). L‘utilisation de premiers exons alternatifs qui sont par la suite couplés aux exons communs pour les locus UGT1A et 2A entraîne la formation de protéines différentes en N-terminale, mais similaires en C-terminale (Gong et al. 2001; Sneitz et al. 2009). Les autres familles UGT résultent plutôt de duplication génique.

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Figure 2. Localisation et organisation génomique des locus UGT1 et UGT2 humains.

Représentation des locus UGT1 et UGT2 sur les chromosomes 2 et 4 respectivement. Les membres de ces familles sont regroupés selon leur degré de similarité de séquence protéique. Figure adaptée de Guillemette et al. 2010.

2.1 UGT1

Le gène UGT1 humain est localisé sur le chromosome 2q37 et possède une structure complexe permettant la formation de nombreux transcrits à partir de ce seul locus. Ce gène s‘étend sur environ 218 kb et contient 18 exons. Treize premiers exons alternatifs, possédant chacun un promoteur spécifique, seront combinés par épissage aux exons communs 2 à 5 en 3‘ du locus (Gong et al. 2001; Mackenzie et al. 2005a). De ces 13 premiers exons, quatre sont des pseudogènes (UGT1A2P, UGT1A11P, UGT1A12P, UGT1A13P), alors que les neuf autres mènent à la formation de polypeptides fonctionnels (UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A5, 1A6, 1A7, 1A8, 1A9, 1A10) avec une partie 3‘ commune. Ces premiers exons alternatifs confèrent la spécificité de substrat, alors que les exons communs encodent pour le domaine de liaison au cosubstrat (Meech and Mackenzie 1997a; Patana et al. 2007). La similarité entre les UGT1A varie entre 48 et 92% et résulte de la duplication d‘exons (Gong et al. 2001). Ceci entraîne donc une spécificité de substrat qui est parfois chevauchante envers les molécules reconnues par les enzymes UGT1A (Mackenzie et al. 2005a; Li et al. 2007; Fujiwara et al. 2009; Itaaho et al. 2010). L‘analyse

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groupes possédant plus de 55 % d‘homologie. Le premier est dérivé de 1A1 et comprend 1A2P à 1A5, alors que le second groupe serait dérivé de 1A6 et composé de 1A7 à 1A13P (Gong et al. 2001; Owens et al. 2005).

De façon similaire, les rats et les souris possèdent un locus UGT1 composé de plusieurs exons 1 combinés aux exons communs, menant ainsi à la formation de protéines uniques en N-terminale, mais identiques en C-terminale (Mackenzie et al. 2005a).

2.2 UGT2

Les enzymes de la famille des UGT2 humaines sont, quant à elles, encodées par de multiples gènes uniques. Ceux-ci sont distribués sur une région d‘environ 1500 kb sur le chromosome 4q13, et comprennent trois membres de la sous-famille UGT2A (2A1, 2A2, 2A3) et 12 membres de la sous-famille UGT2B (2B29P, 2B17, 2B15, 2B10, 2B27P, 2B26P, 2B7, 2B11, 2B28, 2B25P, 2B24P, 2B4). La grande homologie de séquence entre les membres des UGT2, environ 70 % et plus, suggère que ces locus résultent de la duplication de segments chromosomiques (Mackenzie et al. 2005a). Les ARNm de UGT2A1 et 2 sont tous les deux transcrits à partir du même gène par l‘utilisation de premiers exons alternatifs combinés à cinq exons communs (Sneitz et al. 2009). Les transcrits d‘UGT2A3 et des UGT2B sont le produit de gènes uniques composés d‘au moins six exons (Turgeon et al. 2000; Mackenzie et al. 2005a; Court et al. 2008). Comme mentionné, il existe une grande homologie entre les membres des sous-familles UGT2, ce qui rend difficile l‘attribution d‘orthologues chez les autres espèces. Par conséquent, la numérotation pour ces autres espèces est faite par ordre chronologique de découverte, tout comme pour les humains. Par contre, lorsque l‘identification d‘orthologues entre les espèces est possible, les gènes sont nommés de façon cohérente (Mackenzie et al. 2005a).

3 Structure protéique

Les protéines des familles UGT1 et 2 humaines sont synthétisées sous la forme de précurseur d‘environ 529 à 534 acides aminés, et possèdent plusieurs domaines protéiques conservés (Figure 3) impliqués dans l‘activité enzymatique et la localisation subcellulaire (Meech and Mackenzie 1997a). Les UGT sont des protéines transmembranaires de type I, résidentes de la membrane du RE et de la membrane péri-nucléaire (Vanstapel et al. 1989). Ceci n‘est pas surprenant étant donné que cette

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dernière est en continue avec la membrane du RE (Anderson and Hetzer 2008). Les données sur la topologie des protéines UGT supportent qu‘environ 95 % de la protéine est localisé du côté luminal du RE. Le 5 % restant forme une queue C-terminale d‘environ 25 résidus qui se trouve du côté cytoplasmique (Meech and Mackenzie 1998). Les protéines UGT démontrent une plus grande similarité de séquence dans la partie C-terminale de la protéine (environ les 250 derniers acides aminés), probablement causée par la présence des résidus responsables de la liaison au cosubstrat (Meech et al. 1996; Patana et al. 2007). Les 280 premiers acides aminés sont quant à eux plus divergents et confèrent la spécificité de substrat de chacune de ces enzymes (Mackenzie 1990b; Xiong et al. 2006; Fujiwara et al. 2009; Kerdpin et al. 2009). Toutes les enzymes UGT contiennent une séquence signature de 29 acides aminés, située dans la portion C-terminale de la protéine (pour UGT1A1 acides aminés 369-397). Cette séquence est commune aux UDP-glycosyltransférases et est responsable de la liaison à différents sucres (Mackenzie et al. 1997; Patana et al. 2007; Xiong et al. 2008).

Figure 3. Représentation schématique de la protéine UGT1A9 et de ses domaines protéiques.

La structure primaire des protéines UGT est constituée de deux domaines principaux, soit la partie amino-terminale responsable de la liaison au substrat et la partie carboxy-terminale impliquée dans la liaison au cosubstrat. Plusieurs motifs de localisation et de rétention à la membrane du RE sont également indiqués, tels le peptide signal, le MRA, le domaine transmembranaire et le motif dilysine. Figure tirée de Guillemette et al. 2010.

La localisation et la rétention des protéines UGT à la membrane du RE impliquent plusieurs domaines protéiques. La séquence des UGT indique la présence d‘un peptide signal d‘environ 20 acides aminés conservé entre les UGT (Kerdpin et al. 2009). Bien qu‘il n‘existe pas de séquence consensus de peptide signal entre les UGT, certains motifs sont conservés dont une région hydrophobe de 10 à 15 résidus. Le peptide signal permet l‘insertion du peptide naissant dans la membrane du RE et est clivé dans la protéine UGT mature (Mackenzie and Owens 1984). Néanmoins, des études ont démontré que la

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protéines UGT, suggérant l‘implication d‘autres domaines protéiques (Ouzzine et al. 1999a). Une analyse préliminaire in silico a suggéré la présence d‘un signal de localisation membranaire dans la portion N-terminale des protéines UGT (Ciotti et al. 1998). La délétion progressive de domaines en N-terminal a démontré la présence d‘une séquence chez UGT1A6, entre les acides aminés 140 et 240, permettant de conférer la localisation d‘une protéine GFP (protéine fluorescente verte) à la membrane du RE (Ouzzine et al. 1999b). Plus spécifiquement, les acides aminés 159-172 (pour UGT1A1), appelés MRA (micro-region anchoring), constituent une séquence d‘acides aminés hydrophobes ayant le potentiel d‘interagir avec la membrane du RE (Ciotti et al. 1998). Cette séquence est retrouvée pour d‘autres UGT, telles UGT1A3, 1A4, 1A5 et 1A6, et pourrait faciliter l‘accès des substrats lipophiles au site actif des enzymes (Ciotti et al. 1998). Deux séquences protéiques conservées entre les UGT ont été identifiées dans la portion C-terminale des protéines. Une région de 17 acides aminés hydrophobes située entre les acides aminés 490-510 (pour UGT1A1) possède une fonction de domaine transmembranaire (TMD). Ce domaine lie la partie N-terminale du côté luminal à la partie C-terminale présente du côté cytosolique de la membrane du RE. Le TMD possède une fonction de rétention au RE, mais est également important pour l‘activité enzymatique. En effet, Ouzzine et collaborateurs ont démontré que la mutation de l‘Asp488 d‘UGT1A6 mène à l‘inactivation de l‘enzyme (Ouzzine et al. 2006). Une queue cytoplasmique de 19-26 acides aminés située en C-terminal est localisée du côté cytoplasmique de la membrane du RE. Cette portion contient un motif dilysine (KXKXX ou KKXX) qui est une séquence conservée entre les UGT (Nilsson et al. 1989; Jackson et al. 1990). Cette séquence d‘acides aminés chargés positivement peut non seulement interagir avec la membrane chargée négativement, mais elle pourrait servir de signal pour la récupération des UGT du golgi vers le RE par la liaison de protéines coatomères (COPI) (Barre et al. 2005).

4 Fonctions des UGT

La voie de biotransformation par les UGT humaines possède trois fonctions principales (Guillemette 2003). Ces enzymes sont connues pour leur rôle central dans la détoxification de nombreuses molécules exogènes, dont plus de 30 % des médicaments prescrits. En effet, environ 35 % des médicaments métabolisés par les enzymes de phase II résultent de l‘action des UGT (Evans and Relling 1999; Ritter 2000; Guillemette 2003; Rowland et al. 2013) (Figure 4). La contribution de ces enzymes UGT est comparable à celle des

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enzymes de phase I CYP3A4/5/7 (Chang and Kam 1999; Zanger and Schwab 2013). Ces dernières sont très bien caractérisées dans la littérature pour leur rôle pharmacologique important, supportant le rôle prépondérant des UGT dans la détoxification des médicaments.

Figure 4. Proportion des molécules pharmacologiques métabolisées par chacune des classes d'enzymes de phase I et II.

ADH, alcool déshydrogénase; ALDH, aldéhyde déshydrogénase; CYP, cytochrome P450; DPD, dihydropyrimidine déshydrogénase; NQO1, NADPH:quinone oxydoréductase; COMT, catéchol O-méthyltransférase; GST, glutathione S-transférase; HMT, histamine méthyltransférase; NAT, N-acétyltransférase; STs, sulfotransférases; TPMT, thiopurine méthyltransférase; UGTs, uridine 5‘-diphosphate glucuronosyltransférases. Figure tirée de Evans et al. 1999.

Les UGT contribuent également à la protection de l‘organisme contre différents carcinogènes alimentaires (PhIP, benzo-[a]-pyrène) et polluants environnementaux (carcinogènes du tabac) (Bartsch et al. 1992; Nowell et al. 1999; Girard et al. 2005; Zhang et al. 2013). Leur expression tissulaire stratégique à différentes portes d‘entrée de ces molécules (foie, tractus gastro-intestinal, voies respiratoires, peau, etc.) supporte ce rôle de protection. Les UGT sont impliquées dans l‘homéostasie de plusieurs molécules endogènes, notamment la bilirubine (Ritter et al. 1991; Ritter et al. 1992), les acides biliaires (Gall et al. 1999), les hormones thyroïdiennes et stéroïdiennes (Liu et al. 1995; Hum et al. 1999).

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5 Expression tissulaire

Des évidences suggèrent que, parmi les 19 UGT humaines, plusieurs présentent un profil d‘expression tissulaire spécifique et hétérogène (Figure 5) (Harding et al. 1988; Ritter et al. 1991; Wooster et al. 1991; Mojarrabi et al. 1996; Strassburg et al. 1997b; Mojarrabi and Mackenzie 1998; Strassburg et al. 1998; Jedlitschky et al. 1999; Court et al. 2008). La littérature supporte que le foie est l‘organe possédant le niveau le plus élevé et la plus grande diversité d‘enzymes UGT exprimées (12 UGT) (Mackenzie et al. 2003b; Izukawa et al. 2009; Ohno and Nakajin 2009; Court et al. 2012). Ceci n‘est pas surprenant étant donné le rôle critique de cet organe dans diverses réactions métaboliques, et la détoxification de molécules exogènes. L‘UGT2B7 est l‘enzyme UGT la plus abondante dans le foie, et l‘UGT1A la plus exprimée étant UGT1A1 (Izukawa et al. 2009; Ohno and Nakajin 2009; Court et al. 2012; Fallon et al. 2013; Sato et al. 2014). Cinq transcrits des UGT1A sont présents au niveau hépatique, à l‘exception de 1A5, 1A7, 1A8 et 1A10 qui possèdent une expression exclusivement extra-hépatique (Strassburg et al. 1997b; Gregory et al. 2004b). L‘expression extra-hépatique des UGT est également importante, entre autres dans le tractus gastro-intestinal, les reins, les voies respiratoires (poumons, fosses nasales, oesophage), les tissus hormono-dépendants (ovaires, testicules, glandes mammaires, prostate), etc. (Gregory et al. 2004b; Chen et al. 2005; Gaganis et al. 2007; Heydel et al. 2010; Court et al. 2012). Ces données démontrent que les UGT sont aussi exprimées dans les autres tissus impliqués dans le métabolisme des médicaments (reins, estomac, petit intestin, côlon) (Ohno and Nakajin 2009; Court et al. 2012). La majorité des données d‘expression tissulaire des UGT résulte de la quantification des transcrits qui est une mesure indirecte de l‘abondance protéique. De plus, la littérature suggère, pour certaines UGT, un manque de corrélation entre l‘expression des transcrits, des protéines et l‘activité enzymatique (Izukawa et al. 2009; Ohtsuki et al. 2012); (Peterkin et al. 2007). Par exemple, l‘expression en ARNm d‘UGT1A1 dans des foies humains est faiblement corrélée avec l‘expression protéique (Rs = 0.488; p < 0.0001) (Izukawa et al. 2009) et avec l‗activité transférase de cette enzyme envers la bilirubine (r = 0.392; p < 0.05) (Jones et al. 2012). Ainsi, une étude plus détaillée de l‘expression protéique des UGT devient nécessaire.

Il est à noter qu‘il existe une grande variabilité interindividuelle de l‘expression protéique des UGT, que ce soit au niveau du foie, mais également dans d‘autres organes (Ritter et al. 1999; Ohtsuki et al. 2012; Achour et al. 2014; Sato et al. 2014). Par exemple, deux

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études ont démontré que l‘expression protéique d‘UGT1A1 dans des échantillons de foies humains pouvait varier de 50 à 100 % (Achour et al. 2014; Sato et al. 2014). L‘activité de glucuronidation est également soumise à une grande variabilité interindividuelle (Sutherland et al. 1993; Court 2010; Milne et al. 2011; Sato et al. 2014). En effet, l‘activité de glucuronidation de l‘estradiol, entre autres prise en charge par l‘enzyme UGT1A1, varie de 92 % dans des foies humains (Court 2010). Les mécanismes pouvant modifier le niveau d‘activité enzymatique, ainsi que les facteurs responsables du patron d‘expression tissulaire de chaque UGT sont toujours à l‘étude.

Figure 5. Distribution tissulaire des UGT1A et 2B humains dans les organes impliqués dans le métabolisme des médicaments.

Pour les protéines UGT1A, la détection des enzymes i1 et des protéines alternatives i2 est également identifiée. Figure basée sur Girard et al. 2007; Strassburg et al 1998.

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6 Régulation de la voie de glucuronidation

L‘élucidation des facteurs qui régulent la voie de glucuronidation permettrait de dresser un plan de la variation interindividuelle. La concentration de nombreuses molécules éliminées par la voie de glucuronidation est soumise à une grande variabilité interindividuelle (Court et al. 2001; Toffoli et al. 2006; Levesque et al. 2008; Beckebaum et al. 2009). Par exemple, l‘exposition à l‘acide mycophénolique (MPA), dérivé de l‘immunosuppresseur mycophénolate mofétil (MMF), varie d‘environ 40 % chez des patients greffés du foie (Beckebaum et al. 2009). La quantité de glucuronides formés (MPAG et AcMPAG) est également soumise à des changements importants variant de 2 à 6 fois entre les patients (Beckebaum et al. 2009). Ces connaissances pourraient potentiellement aider à prédire le métabolisme de nombreuses molécules pharmacologiques et leurs effets secondaires. Différents mécanismes moléculaires connus pour influencer l‘expression et l‘activité des UGT seront brièvement abordés dans cette section. D‘autres facteurs, tels les facteurs environnementaux, sont également connus pour contribuer à la variabilité interindividuelle de la voie de glucuronidation, mais ne seront pas abordés dans cette introduction (Burchell and Coughtrie 1997; Court 2010). La littérature supporte que des altérations de la voie de glucuronidation pourraient influencer l‘exposition d‘un individu à différents carcinogènes. À long terme, ceci pourrait moduler la susceptibilité à certaines pathologies, telles le cancer (Guillemette et al. 2000a; Guillemette et al. 2001; Vogel et al. 2001; Zheng et al. 2001; Gsur et al. 2002; Strassburg et al. 2002; Guillemette 2003; Chen et al. 2010). De plus, quelques études rapportent que la modulation de l‘activité de glucuronidation systémique pourrait influencer la réponse pharmacologique et la survenue d‘effets indésirables (Iyer et al. 2002; Sun et al. 2006; Lazarus et al. 2009; Sun et al. 2013).

6.1 Régulation au niveau génomique/transcriptomique

Parmi les mécanismes moléculaires permettant de réguler la voie de glucuronidation se retrouvent les variations du nombre de copies de gènes (CNV; copy number variation), les facteurs de transcription, les polymorphismes génétiques, les micro-ARN, la méthylation de l‘ADN / désacétylation des histones et l‘épissage alternatif. La littérature supporte l‘influence de certains de ces mécanismes sur la modification du phénotype de glucuronidation et sur la réponse pharmacologique (Gagnon et al. 2006; Belanger et al. 2010; Guillemette et al. 2010; Verreault et al. 2010; Dluzen et al. 2014).

(42)

Les facteurs de transcription participent à la variabilité de l‘expression des gènes UGT. De nombreux facteurs de transcription sont répertoriés pour influencer l‘expression des UGT1A et 2B, et une liste non exhaustive est fournie (Tableau 1). Par exemple, l‘expression d‘UGT1A1, qui est responsable du métabolisme de la bilirubine, est bien connue pour être positivement régulée par le facteur aryl-hydrocarbon (AhR) (Sugatani et al. 2004). Ce facteur est activé par la liaison d‘un ligand exogène (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p –dioxin (TCDD), β-naphtoflavone) ou endogène tel la bilirubine (Phelan et al. 1998; Birnbaum and Tuomisto 2000; Olinga et al. 2008). Cette liaison permet la translocation de AhR au noyau et la reconnaissance de l‘élément de réponse aux xénobiotiques (XRE; xenobiotic response element) qui est présent dans le promoteur d‘UGT1A1 (Phelan et al. 1998; Yueh et al. 2003). Des mutations affectant la séquence reconnue par ces facteurs de transcription dans le promoteur des gènes UGT pourraient, entre autres, faire partie des mécanismes pouvant influencer la voie de glucuronidation (Lankisch et al. 2005; Mackenzie et al. 2005b; Caillier et al. 2007; Lankisch et al. 2008). De plus, certains de ces facteurs sont exprimés exclusivement dans certains tissus, ce qui affecte également l‘expression des UGT (Gardner-Stephen and Mackenzie 2008; Mackenzie et al. 2010).

Tableau 1. Facteurs de transcription influençant l’expression des gènes UGT.

Facteurs de transcription UGT ciblées Référence bHLH-PAS

HNF1α UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A8,

1A9, 1A10, 2B7, 2B17 (Bernard et al. 1999; Gregory et al. 2000; Ishii et al. 2000; Gregory et al. 2004a; Wells et al. 2004; Gardner-Stephen et al. 2005; Gardner-Stephen and Mackenzie 2007b; Ramirez et al. 2008)

HNF1β UGT1A3, 2B17 (Gregory et al. 2000)

Pbx2 UGT2B17 (Gregory and Mackenzie 2002)

AhR UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6,

1A9

(Sugatani et al. 2004; Lankisch et al. 2008)

bZIP

HNF4α UGT1A1, 1A6, 1A9 (Barbier et al. 2005; Gardner-Stephen and Mackenzie 2007a)

NRF2 UGT1A1, 1A6 (Munzel et al. 2003; Yueh and Tukey 2007)

NR

PXR UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6 (Rae et al. 2001; Gardner-Stephen et al. 2004)

(43)

2005; Erichsen et al. 2010)

LXR UGT1A3 (Verreault et al. 2006)

PPARα UGT1A1, 1A3, 1A4, 1A6,

1A9, 2B4 (Barbier et al. 2003a; Barbier et al. 2003b; Senekeo-Effenberger et al. 2007)

AR UGT2B15, 2B17 (Chouinard et al. 2007)

Catégories de facteurs de transcription : bHLH-PAS : « basic-helix-loop-helix/Per-ARNT-Sim » ; bZIP : « basic leucine zipper » ; NR : « nuclear receptor »

Le nombre de polymorphismes génétiques répertoriés pour les gènes UGT humains est assez impressionnant (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/). Plusieurs de ces polymorphismes sont liés à des pathologies ou à une modification de la réponse pharmacologique (revu dans (Guillemette 2003; Lazarus et al. 2009; Stingl et al. 2014)). Un exemple probant est un polymorphisme dans le promoteur d‘UGT1A1, caractérisé par la présence d‘une répétition supplémentaire de TA dans la boîte TATA. Ce polymorphisme, nommé UGT1A1*28 ((TA)7TAA en remplacement de ((TA)6TAA)), est lié à

une diminution de l‘expression de l‘enzyme UGT1A1 (50 %) et à une diminution de l‘activité de glucuronidation cellulaire (30-50%) (Bosma et al. 1995; Iyer et al. 1998; Iyer et al. 2002). Le polymorphisme UGT1A1*28 est associé au syndrome de Gilbert, causé par une augmentation de la bilirubine non conjuguée (Bosma et al. 1995). De nombreuses études rapportent également que ce génotype est associé à une exposition accrue au métabolite actif de l‘irinotécan, le SN-38 (Iyer et al. 2002; Paoluzzi et al. 2004; Toffoli et al. 2006). Cette molécule est utilisée dans le traitement du cancer colorectal. De plus, le polymorphisme 1A1*28 est associé à un risque plus élevé de développer des neutropénies sévères (grades 3-4) sous traitement à l‘irinotécan (Iyer et al. 2002; Toffoli et al. 2006; Hoskins et al. 2007; Ruzzo et al. 2008; Glimelius et al. 2011). Malgré la caractérisation d‘un grand nombre de polymorphismes génétiques des UGT, ceux-ci n‘expliquent pas en totalité la grande variabilité de la voie de glucuronidation (Court et al. 2001; Krishnaswamy et al. 2005). Par exemple, tel que décrit précédemment, l‘influence du polymorphisme d‘UGT1A1*28 sur la modulation de la réponse à l‘irinotécan est bien connue, mais plusieurs groupes continuent d‘évaluer le rôle de polymorphismes génétiques additionnels, afin de raffiner la catégorisation des patients à risque de développer ces effets indésirables (De Mattia et al. 2013; Levesque et al. 2013; Liu et al. 2013). Ceci supporte donc la pertinence d‘étudier d‘autres mécanismes responsables de cette variabilité.

(44)

La variation du nombre de copies de gènes UGT a également été rapportée dans la littérature (Wilson et al. 2004; Jakobsson et al. 2006; Swanson et al. 2007). En effet, la variation du nombre de copies d‘UGT2B17 et 2B28 chez les Caucasiens est assez élevée, 27 % et 13.5 % pour 2B17 et 2B28 respectivement, et ces délétions peuvent survenir dans les deux gènes de façon concomitante. Environ 57 % des Caucasiens ont au moins une délétion dans un de ces deux gènes (Menard et al. 2009). Des sites de recombinaison putatifs riches en purines ont été identifiés aux extrémités de ces gènes (Menard et al. 2009). Les données supportent que la délétion d‘au moins deux copies de 2B17 ou 2B28 augmente le risque de récidive biochimique (2.26 fois; P = 0.0007) de cancer de la prostate après prostatectomie radicale (Nadeau et al. 2011). De plus, la délétion d‘UGT2B17 est également associée à une diminution des niveaux sériques d‘androstanediol-17-glucuronide et une augmentation du risque de développer un adénocarcinome du poumon chez la femme (OR = 2.8; 95 % intervalle de confiance = 1.2 - 6.3) (Gallagher et al. 2007; Swanson et al. 2007). La délétion de ces gènes a donc le potentiel d‘influencer la glucuronidation systémique et subséquemment l‘exposition des individus à différentes molécules, telles les hormones (UGT2B17 : dihydrotestostérone (DHT), androstérone, testostérone) qui sont normalement éliminées par la glucuronidation (Beaulieu et al. 1996).

Quelques études supportent que la méthylation de certains gènes puisse aider à prédire l‘efficacité thérapeutique de certaines molécules (Plumb et al. 2000; Ferreri et al. 2004; Esteller 2005). Dans cette optique, la méthylation du promoteur des UGT représente donc une option intéressante supplémentaire qui pourrait aider à prédire la variabilité de cette voie. L‘hyperméthylation de l‘ADN et l‘hypoacétylation des histones ont été corrélées à une répression de la transcription d‘UGT1A1 dans des lignées de cancer colorectal (Gagnon et al. 2006). Des évidences in vivo supportent également une corrélation entre la méthylation du site -4 CpG (99 nt à partir de l‘ATG) du promoteur d‘UGT1A1, l‘expression protéique de cette enzyme (R = 0.54; P = 0.008) et l‘activité de conjugaison de la bilirubine (R = 0.73; P < 0.00001) (Yasar et al. 2013). La méthylation du promoteur de certains gènes UGT semble également participer à l‘expression tissulaire spécifique de ces enzymes (Oda et al. 2013; Oda et al. 2014).

Des données récentes supportent qu‘une autre modification épigénétique pourrait influencer l‘expression des UGT. En effet, des évidences émergent supportant que

Figure

Figure 1. Représentation schématique de la réaction de glucuronidation.
Figure 2. Localisation et organisation génomique des locus UGT1 et UGT2 humains.
Figure 3. Représentation schématique de la protéine UGT1A9 et de ses domaines  protéiques
Figure  4.  Proportion  des  molécules  pharmacologiques  métabolisées  par  chacune  des classes d'enzymes de phase I et II
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