9 Régulation de l‘activité enzymatique au niveau protéique
10.6 Étudier l‘influence de la modulation de l‘expression endogène des protéines
cellulaire
Les études fonctionnelles réalisées jusqu‘à maintenant utilisaient seulement des modèles de surexpression sans évaluer l‘influence des protéines i2 endogènes sur l‘activité de glucuronidation de la cellule. Afin de considérer cette question, nous avons étudié l‘effet sur la glucuronidation de la répression des formes i2 endogènes dans deux lignées dérivées de cancers du côlon, HT115 et LOVO. En effet, nous avons démontré
sains et tumoraux (Bellemare et al. 2011). Également, les lignées HT115 et LOVO ont été choisies car elles montrent des niveaux différents d‘expression de i2 :i1, les HT115 exprimant les i2 à une proportion de 80 % des i1, alors que les LOVO ont une expression de 50 % de protéines alternatives comparativement aux enzymes. Afin de réprimer l‘expression des formes i2, nous avons opté pour l‘utilisation de petits ARN interférents (siARN) dirigés contre l‘exon 5b, donc spécifiques aux formes i2. Cet ARN interférent ciblait donc tous les variants menant à la formation des protéines i2.
Une répression transitoire partielle de 50 % a été obtenue en ARNm et confirmée par une diminution des niveaux de protéines i2 par immunobuvardage pour les deux lignées cellulaires. Afin de confirmer que cette répression est spécifique aux i2, nous avons quantifié en ARNm et en protéine l‘expression des enzymes i1 et celle d‘un gène contrôle (UGT2B7), et avons démontré que leurs expressions ne sont pas affectées par ce traitement. Nous avons, par la suite, comparé les cellules contenant un ARN interférent ne ciblant aucun gène humain connu (contrôle) et les cellules transfectées avec le petit ARN interférent contre l‘exon 5b, pour leur capacité de glucuronidation envers divers substrats des enzymes UGT. Plusieurs substrats des UGT1A ont été utilisés afin de bien cibler la diversité des enzymes exprimées dans nos lignées cellulaires HT115 et LOVO. En effet, la bilirubine est métabolisée par UGT1A1, le SN-38 par 1A1/1A7/1A9, l‘estradiol par 1A1/1A3/1A8/1A10 et le MPA par 1A8/1A9, et nous avons démontré en ARNm qu‘elles sont exprimées dans nos modèles cellulaires. Étant donné que l‘ARN interférent cible toutes les i2 et que nous avons démontré qu‘une i2 peut affecter l‘activité de glucuronidation de plusieurs enzymes i1, il était nécessaire de bien documenter l‘activité de glucuronidation pour ces différentes i1.
Nos résultats démontrent que la répression partielle des formes i2 entraîne une augmentation significative de l‘activité de glucuronidation pour tous les substrats testés dans les deux lignées cellulaires. Les résultats de ces recherches sont présentés dans le chapitre VII (« Alternative-Splicing Forms of the Major Phase II Conjugating UGT1A Gene Negatively Regulate Glucuronidation in Human Carcinoma Cell Lines »).
10.7 Étudier l’influence de la modulation de l’expression endogène
des protéines alternatives i2 sur la réponse pharmacologique
à un agent anticancéreux
L‘objectif de ce volet était d‘étudier le rôle des protéines alternatives i2 dans la réponse pharmacologique, ce qui nécessitait l‘utilisation d‘un modèle de répression cellulaire stable. Afin de pallier aux limites du modèle de siARN et atteindre nos objectifs de recherche, nous avons développé un modèle de répression stable de l‘expression des protéines i2 en ciblant les messagers v2/v3 responsables de leur formation. Pour ce faire, nous avons conçu différents petits ARN interférents en forme d‘épingles à cheveux (shARN) ciblant l‘exon 5b et son 3‘-UTR, que nous avons par la suite testés dans la lignée cellulaire de cancer du côlon HT115. Les shARN ont été délivrés à l‘aide de lentivirus afin de cibler autant les cellules en division active que les cellules en dormance (phase G0), augmentant ainsi l‘efficacité de transfection. Nous avons donc réussi à diminuer de façon spécifique l‘expression des i2 dans les HT115, sans affecter l‘expression des enzymes i1. Nous avons validé que la répression en ARNm des isoformes i2 est significative (49 %; p < 0.01) et stable au-delà de 200 jours après l‘infection par lentivirus, pour le shARN démontrant la plus forte inhibition.
L‘agent chimiothérapeutique SN-38 a été retenu étant donné que les cellules HT115 expriment de façon prédominante l‘enzyme UGT1A1 responsable de son métabolisme. L‘agent anticancéreux SN-38 est utilisé dans le traitement du cancer colorectal métastatique et semblait donc approprié pour tester la réponse des cellules HT115 dérivées d‘une tumeur du côlon. À titre de lignée de référence, nous avons utilisé les cellules HT115 infectées par un shARN ne ciblant aucun gène humain connu. Nous avons d‘abord validé que la répression partielle des formes i2 entraîne une augmentation significative de la glucuronidation du SN-38 (126%), à l‘aide d‘essai enzymatique in vitro. Étant donné que la répression des i2 augmente l‘élimination de l‘agent pharmacologique, il est supposé que ces cellules aient donc un avantage de survie. Nous avons donc étudié la viabilité des cellules (test Alamar Blue) suite à un traitement avec des concentrations croissantes de SN-38. Nos données démontrent un avantage de survie pour les cellules ayant un niveau inférieur de protéines i2. Ce résultat est soutenu par un changement de 2x de la concentration inhibitrice médiane (IC50) du médicament, comparativement à la
Afin de mieux caractériser la lignée, nous avons priorisé des approches moléculaires non ciblées. Tout d‘abord, notre étude a caractérisé l‘effet de la répression des i2 sur l‘expression génique globale des cellules HT115, à l‘aide de puce d‘expression génique contenant plus de 47 000 sondes qui permettent d‘évaluer l‘expression de 31 424 gènes (« microarray »). Nous avons comparé la lignée HT115 contrôle et celle réprimée en i2 en conditions basales (15 % FBS), mais également sous traitement SN-38. Les données ont par la suite été analysées à l‘aide du logiciel Flexarray, conçu spécialement pour étudier les données d‘expression génique, afin de cibler les transcrits et les gènes dont l‘expression était significativement modulée (seuil : 1.2; p ≤ 0.01). Des analyses in silico ont par la suite été réalisées à l‘aide du logiciel « Ingenuity Pathway Analysis » permettant de regrouper les gènes modulés selon leur fonction cellulaire, et ainsi déterminer les processus cellulaires significativement affectés par la répression des protéines alternatives i2.
Notre étude a également caractérisé l‘effet de la répression des i2 sur l‘expression protéique globale en conditions basales. Pour ce faire, nous avons utilisé une méthode de marquage des acides aminés en culture cellulaire. L‘approche protéomique SILAC (« Stable Isotope Labeling of Amino Acids in Cell Culture ») est une technique qui utilise le marquage isotopique stable et complet de certains acides aminés endogènes (lysine et arginine), afin de quantifier les variations d‘expression protéique en spectrométrie de masse. Brièvement, un lysat cellulaire de la lignée marquée (KD i2) est mélangé avec un lysat de la lignée contrôle non marquée. Le protéome cellulaire est par la suite identifié en spectrométrie de masse. Le marquage de certains acides aminés cause une augmentation de la masse des peptides en spectrométrie de masse, ce qui rend alors possible de différencier les peptides appartenant à la lignée KD i2 et ceux de la lignée contrôle. L‘expression est alors représentée par un ratio pour les protéines identifiées comme étant différentiellement exprimées (seuil : 1.2; p ≤ 0.05). Cette méthode nous a permis de quantifier les changements d‘expression protéique dans un même échantillon, réduisant ainsi les variations techniques pouvant survenir lors de la préparation de ceux-ci et lors de l‘analyse indépendante de plusieurs échantillons en spectrométrie de masse.
Nos résultats ont démontré que la répression des i2 est associée à une augmentation de l‘expression d‘un nombre assez limité de gènes et de protéines, mais ayant pour la majorité un lien avec les fonctions antioxydantes cellulaires. Basé sur ces résultats, nous avons également quantifié les dérivés réactifs de l‘oxygène (« ROS ») intracellulaires à
l‘aide d‘un marqueur fluorescent (état oxydé) détecté en cytométrie en flux, en conditions basales et suite au traitement avec le SN-38. La littérature démontre que le SN-38 est connu pour induire un stress oxydatif cellulaire nous permettant ainsi de l‘utiliser comme traitement, afin d‘étudier la réponse oxydative de notre modèle cellulaire dont l‘expression des i2 est réprimée (Conklin 2004; Timur et al. 2005). Les données supportent une diminution des composés toxiques ROS dans la lignée KD i2 comparativement à la lignée contrôle.
Enfin, afin d‘étudier le mécanisme par lequel les protéines i2 pourraient influencer le stress oxydatif, nous avons réalisé une analyse préliminaire de l‘interactome des protéines UGT1A. La littérature démontre bien la capacité des UGT d‘interagir avec d‘autres protéines et nous savons également que les i2 ont le potentiel d‘influencer l‘activité enzymatique des enzymes i1 par interaction physique. Nous avons donc utilisé la purification d‘affinité à l‘aide d‘anticorps spécifiques à chaque classe de protéines UGT1A (i1 ou i2) dans des fractions subcellulaires (S9) de tissus de rein et d‘intestin humains couplée à la spectrométrie de masse. Nos données démontrent que les i2 interagissent avec certaines enzymes antioxydantes, telles la catalase et la peroxyrédoxine 1. Ceci suggère donc que les protéines alternatives i2 puissent moduler le stress oxydatif par interaction protéique avec ces enzymes en prévenant la formation d‘oligomères essentiels à leur activité enzymatique. Les résultats de ces recherches sont présentés dans le chapitre VIII (« Dual Roles for Splice Variants of the Glucuronidation Pathway as Regulators of Cellular Metabolism »).