Observations microscopiques

Dans le cadre de la rédaction de l’article, les cocultures amibes-levures ont été incubées 72 h à 20°C afin de visualiser les interactions par MET (voir Résultats et

128

Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre

H. vermiformis et Candida spp.). Ce temps d’incubation avait été choisi arbitrairement

pour illustrer les cocultures à un temps moyen et afin d’obtenir des quantités suffisantes de micro-organismes observables. Ces observations microscopiques ont par la suite été complétées, d’une part par d’autres expériences en MET avec des temps d’incubation de 24 h et de 168 h, à 20°C (Figure 47). D’autre part, en réalisant des observations des micro- organismes en cocultures et adhérés à une surface PVC (Figure 49), tel qu’ils pourraient l’être à l’intérieur des tubulures d’USD, après différents temps d’incubation à 20°C (de 3 à 42 jours) et observation au MEB (Figure 50).

1) Microscopie électronique à transmission

a) Observations des cocultures en suspension

Aux différents temps d’incubation (24, 72 et 168 h), les levures ont été observées sous forme de blastospores, dont certaines se trouvaient en bourgeonnement (Figure 47-A) ; ce détail montre bien que la présence de salive et/ou d’amibes libres favorise ou du moins n’inhibe pas la prolifération de Candida. De même, H. vermiformis a été observée sous forme de kystes (Figure 47-B) mais également de trophozoïtes (Figure 47-C, D, E et F), quelle que soit le temps d’incubation, ce qui montre que les amibes libres survivent naturellement dans les conditions de l’expérience.

Comme décrit dans l’article pour le cas d’une observation après 72 h d’incubation (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) –

Interactions entre H. vermiformis et Candida spp.), après 24 h ou même 168 h

d’incubation des cocultures, H. vermiformis est capable d’interagir (Figure 47-C et E) et d’internaliser les levures du genre Candida (Figure 47-D et F). De plus, après 168 h, de nombreux micro-organismes, provenant soit de l’eau de réseau, soit de la salive, soit du cytoplasme des amibes (ARB ou endosymbiotes libérés), ont pu être observés dans le milieu à proximité des levures et des amibes libres (Figure 47-E). Cependant, la présence de ces micro-organismes, représentant une source potentielle de nutriments pour les prédateurs que sont les amibes, n’empêche pas H. vermiformis d’interagir et d’internaliser les levures (Figure 47-C, D, E et F).

129

Figure 47 : Observations en MET de C. albicans (A) et de H. vermiformis (B) en coculture dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 24 h (C-D) et 168 h (E-F)

d’incubation à 20°C (n=2).

b) Marquage immunocytochimique

Afin de savoir si, en plus de pouvoir les héberger dans leur cytoplasme, les amibes sont capables de digérer des micro-organismes de grande taille tels que les levures, un marquage immunocytochimique des levures a été réalisé. Dans l’article, les résultats obtenus par cette expérience ont été décrits, mais non illustrés (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 II. 1) Article : Water Research (2012) – Interactions entre

H. vermiformis et Candida spp.). Sur la figure 48 les billes d’or colloïdal se retrouvent

130

endroits au niveau de la paroi. La cible de l’anticorps primaire utilisé (3H8) est cependant intrapariétale, c’est-à-dire à l‘intérieur de la paroi fongique, et les billes d’or devraient donc se retrouver principalement dans la paroi (Marcilla et al., 1999). L’explication pourrait être la température d’incubation utilisée pour l’expérience (20°C) ; la molécule ciblée par l’anticorps, intrapariétale dans des conditions de culture plus classiques (37°C par exemple), n’est peut- être pas correctement transportée à la paroi dans les conditions expérimentales et se retrouverait ainsi dans le cytoplasme. Toutefois, le marquage réalisé reste spécifique des levures du genre Candida ; le marquage est bien ciblé sur les levures et non pas diffus dans le milieu de culture. De ce fait, les résultats obtenus permettent bien d’affirmer que les débris cellulaires, visualisés sur la figure 48-C et zoomés sur la figure 48-D, sont des levures en cours de digestion dans une vacuole de H. vermiformis.

Les amibes libres H. vermiformis se nourrissent donc de levures dans les conditions expérimentales utilisées, sans toutefois détruire la totalité de la population fongique, puisque la prolifération de Candida spp. est augmentée en présence d’amibes libres.

Figure 48 : Observations en MET de C. albicans et de H. vermiformis en coculture dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 72 h d’incubation à 20°C et marquage immunocytochimique (A-D) (n=2).

131

2) Microscopie électronique à balayage

Les cocultures amibes-levures ont ensuite été réalisées sur des coupons de PVC, dans l’eau de réseau filtrée avec 10% de salive filtrée (v/v) ; une concentration plus forte en salive, et donc en nutriments, a été choisie pour les expériences de MEB afin de faciliter l’adhérence des micro-organismes à la surface PVC, tout en restant dans des conditions pouvant être retrouvées dans les USD. D’une part les coupons de PVC, incubés seuls dans l’eau de réseau filtrée, 72 h à 20°C, ont été observés en MEB (Figure 49) : ces coupons apparaissent comme étant des surfaces très rugueuses, très irrégulières (Figure 49-A) et de ce fait propices à l’adhérence microbienne. De plus, des cristaux de sels minéraux, probablement de calcium et provenant de l’eau de réseau, ont été retrouvés déposés sur les surfaces PVC (Figure 49-B) ; de tels dépôts favorisent également l’adhérence.

Figure 49 : Observations en MEB de coupons de PVC incubés dans de l’eau filtrée, après 72 h d’incubation à 20°C (A-B) (n=1).

C. albicans et H. vermiformis ont été cocultivées sur ces coupons de PVC, dans l’eau

avec 2% de salive filtrée (v/v), à 20°C pendant 3, 15 et 42 jours avant d’être observées en MEB (Figure 50).

Après 3 jours d’incubation, quelques amibes et quelques levures étaient visibles, adhérées à la surface PVC (Figure 50-A). Des interactions entre ces micro-organismes, comme observé en MET (voir Résultats et Discussion Chapitre 3 III. 1) Microscopie

électronique à transmission), ont été observées (Figure 50-B) : sur cette image, une

levure sous forme de blastospore est englobée par une amibe (trophozoïte). Après 15 jours d’incubation, les levures se sont multipliées, de nombreuses blastospores sont adhérées au PVC, certaines sont même en cours de bourgeonnement (Figure 50-C). La surface du

132

coupon étant déjà très irrégulière (Figure 49-A), les « filaments » observés autour des micro- organismes sont soit des rugosités du PVC, soit de la matrice polysaccharidique.

Figure 50 : Observations en MEB de C. albicans et de H. vermiformis en coculture sur coupons de PVC, dans de l’eau filtrée avec 2% de salive filtrée (v/v) après 3 jours (A-B), 15 jours (C-D) et 42 jours (E-F) d’incubation à 20°C (n=1).

Dans le biofilm fongique nouvellement formé, de nombreuses bactéries sont visibles (Figure

50-C) ; ces bactéries proviennent soit de l’eau de réseau ou de la salive et auraient résisté à

l’étape de filtration (mais c’est peu probable), soit du cytoplasme des amibes (dans le cas d’endosymbiotes ou d’ARB libérés). Tout comme après 3 jours d’incubation, des interactions amibes-levures sont visibles (Figure 50-D) : des blastospores se retrouvent sur un amas de trophozoïtes, dont un, ayant une extrémité allongée, semble avoir formé un pseudopode.

133

Enfin après 42 jours d’incubation à 20°C, le biofilm microbien s’est développé, une matrice extracellulaire épaisse est visible, ainsi que de nombreuses levures, toujours sous forme de blastospores et en cours de bourgeonnement (ce qui montre que les conditions de culture sont assez favorables pour leur croissance) (Figure 50-E et F). En revanche, les amibes, qui se retrouvent agglomérées avec les levures dans le biofilm, ont une morphologie différente. Leur forme est plus arrondie et leur surface semble ridée, plissée (Figure 50-E et F), ce qui correspond certainement à des amibes enkystées.