Influence de la composition de la salive utilisée

Plusieurs traitements ont été effectués sur la salive, dans le but de déterminer plus précisément quels constituants salivaires étaient à l’origine de l’augmentation de la survie des levures. Au total, six salives différentes ont été testées sur les trois espèces de levures : salive centrifugée, salive filtrée, salive DTT, salive chauffée, salive < 5 K et salive < 30 K (voir Matériels et Méthodes Chapitre 1 III. 2) Préparation des salives).

a) Salive centrifugée VS salive filtrée

Initialement, la salive utilisée était uniquement centrifugée, et pouvait de ce fait contenir quelques bactéries orales potentiellement à l’origine de contaminations sur les géloses, lors du dénombrement des UFC de levures. La salive a donc été par la suite utilisée centrifugée et filtrée. Afin de vérifier que l’étape de filtration ajoutée ne modifiait pas l’effet sur la survie des levures préalablement observé avec la salive centrifugée à 27°C, une étude comparative a été réalisée, avec les mêmes concentrations de chacune des deux salives sur les trois espèces de levures (seule la concentration 5% de salive (v/v) est représentée sur la figure 34).

Les résultats ont montré que l’effet de la salive filtrée sur la croissance de Candida spp. était similaire à l’effet de la salive centrifugée. Après les 360 h de l’expérience, C. albicans (Figure 34-A) et C. parapsilosis (Figure 34-C) ont vu leur croissance augmentée de 2 logs UFC/mL, et C. glabrata (Figure 34-B) est passée de log 5 à log 6 UFC/mL, comparé au témoin sans salive. La filtration sur membrane 0,22 µm n’a donc pas éliminé la ou les molécule(s) de la salive active(s) sur la croissance des levures dans l’eau.

De plus, comme observé dans l’article (voir Résultats et Discussion Chapitre 2 I. 2) Article : FEMS Microbiology Letters (2011) – Influence de la présence de salive), les résultats obtenus sur les trois espèces de Candida étaient similaires avec 2, 5 et 10% de salive (v/v). Pour la suite des analyses, seules les concentrations de 2% et 5% de salive ont été utilisées (v/v).

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Figure 34 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée en présence de 5% (v/v) de salive centrifugée ou filtrée à 27°C (n=2).

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b) Salive filtrée VS salive DTT

La prolifération des levures étant tout aussi favorisée en présence de salive filtrée que de salive centrifugée, et la salive filtrée n’étant pas chargée en micro-organismes contaminants, pour la suite des analyses, la salive filtrée a été utilisée comme témoin référence.

La salive a d’une part été traitée au DTT, agent capable de couper les ponts disulfures des protéines contenant des acides aminés sulfurés, et générant leur dénaturation. L’étude comparative de la survie des levures dans l’eau filtrée à 27°C en présence de 5% de salive filtrée et de 5% de salive DTT (Figure 35) a montré que le traitement au DTT était sans effet sur la survie de C. parapsilosis en présence de salive (Figure 35-C). En revanche, C.

albicans et surtout C. glabrata semblaient plus sensibles ; leur survie en présence de salive

DTT était plus faible qu’en présence de salive filtrée (Figure 35-A et B). Par exemple après 360 h d’incubation, la concentration de C. albicans en présence de salive DTT était de 4,3 logs, contre 6,8 logs UFC/mL en présence de salive filtrée (Figure 35-A).

Le fait de dénaturer certaines protéines salivaires pourrait diminuer les sources de nutriments apportés aux levures par la salive. Cependant, les levures survivent toujours mieux en présence de salive traitée au DTT qu’en absence totale de salive dans l’eau ; même en dénaturant certaines protéines, la survie des levures reste très élevée comparativement au témoin levures. L’effet de la salive sur la prolifération des levures dans l’eau serait donc dû à l’action de plusieurs molécules différentes.

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Figure 35 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée ou de salive DTT à 27°C (n=2).

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c) Salive filtrée VS salive chauffée

La survie des levures dans l’eau à 27°C, a été comparée en présence de 5% de salive filtrée et de 5% de salive chauffée 30 min à 100°C (Figure 36).

Comme observé dans le cas de la salive traitée au DTT, le traitement de la salive par la chaleur n’a eu aucun effet dans le cas de l’espèce C. parapsilosis (Figure 36-C). Ces résultats confirment l’hypothèse déjà émise : l’espèce C. parapsilosis est plus résistante que les autres espèces de Candida testées. De même, le traitement de la salive à la chaleur n’a pas d’effet significatif sur la survie de C. glabrata dans l’eau (Figure 36-B). En revanche, la croissance de C. albicans est légèrement plus faible en présence de salive chauffée que de salive filtrée non chauffée (diminution de plus de 1 log UFC/mL) (Figure 36-A).

Dans les deux cas, comme noté précédemment, les levures survivent toujours mieux dans l’eau en présence de salive traitée par la chaleur qu’en absence de salive ; même en dénaturant certaines molécules telles que des enzymes, la survie des levures reste très élevée comparé au témoin levures. Ces résultats confirment l’existence dans la salive de plusieurs molécules différentes favorisant la survie et/ou la prolifération des levures dans l’eau.

De plus, il semblerait que les traitements exercés sur la salive aient une influence différente sur la prolifération des trois espèces de Candida testées ; cela signifierait que les trois espèces testées n’utilisent pas forcément les mêmes molécules salivaires comme source de nutriments.

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Figure 36 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée (n=2) ou chauffée à 27°C (n=1).

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d) Salive filtrée VS salives fractionnées

La salive a été fractionnée sur membranes afin d’obtenir des filtrats contenant des molécules ayant une taille inférieure à la taille des pores de la membrane. Un filtrat < 5 KDa et un filtrat < 30 KDa ont ainsi été obtenus et leur effet sur la prolifération des levures dans l’eau a été comparé à celui de la salive filtrée non fractionnée (Figure 37).

C. parapsilosis, une fois de plus, est l’espèce la plus résistante et la moins exigeante sur les

sources de nutriments disponibles ; la survie de C. parapsilosis est approximativement la même en présence de salive filtrée et en présence de salive < 5 K ou < 30 K (Figure 37-C). Pour C. albicans, la même observation que dans le cas de la salive traitée au DTT ou à la chaleur peut être faite ici : la croissance de C. albicans est plus faible en présence de salives fractionnées que de salive filtrée, en particulier pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure

37-A). Toutefois cette croissance est toujours beaucoup plus élevée par rapport au témoin

levures. Par exemple à 168 h d’incubation, une concentration de levures de seulement 0,8 logs UFC/mL est retrouvée en absence de salive, contre : 4,7 logs en présence de salive < 5 K, 5,2 logs en présence de salive < 30 K et 6,1 logs en présence de salive filtrée.

Pour C. glabrata, l’effet est plus marqué : dès 48 h d’incubation, la survie des levures est plus faible en présence de salives fractionnées qu’en présence de salive filtrée, jusqu’à une diminution de plus de 2 logs UFC/mL à 168 h d’incubation (Figure 37-B). La croissance de

C. glabrata en présence de salives fractionnées devient même comparable à celle du témoin

levures, pour les temps d’incubation ≥ 72 h (Figure 37-B).

Ces résultats confirment que chaque espèce de Candida utilise plusieurs molécules salivaires comme source de nutriments, et que les molécules utilisées peuvent être différentes d’une espèce à l’autre. De plus, cette partie du travail montre que certaines des molécules salivaires métabolisées par les levures ont une taille > 30 KDa, mais que la plupart d’entre elles ont une taille < 5 KDa (Figure 37).

L’effet positif de la salive sur la croissance des levures du genre Candida dans l’eau de réseau filtrée serait donc dû à plusieurs molécules, dont la plupart seraient de nature protéique, au vue de la grande proportion des protéines entrant dans la composition de la salive, résistantes au DTT et à la chaleur et auraient une taille moléculaire < 5 KDa.

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Figure 37 : Survie de C. albicans (A), C. glabrata (B), et C. parapsilosis (C), dans l’eau filtrée en présence de 5% (v/v) de salive filtrée, de salive <5 K ou <30 K à 27°C (n=2).

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