71
Chapitre III. Objectifs des travaux de cette
thèse
Dans la cadre de ma thèse, deux objectifs principaux m’ont été confiés. L’un comme l’autre constituent des travaux de recherche fondamentale visant à évaluer de nouveaux concepts de ciblage thérapeutique des GBM.
1.
Objectif 1 : analyse dans des cellules de GBM et dans la population
de CSC, de la spécificité du ciblage de la voie hedgehog et des
propriétés cytotoxiques d’une prodrogue dérivée de la cyclopamine
Cliniquement, les gliomes en général et les GBM en particulier présentent une résistance importante aux traitements chirurgicaux, radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques ainsi qu’un taux très élevé de récidive. L’association de ces traitements permet d’augmenter la survie médiane des patients atteints de GBM. En effet, cette survie est de trois à six mois après résection chirurgicale conventionnelle, et de 12 mois si on y associe la radiothérapie. En 2005, un protocole associant le TMZ, un agent alkylant de l’ADN, à la radiothérapie après résection a permis d’augmenter la survie médiane globale des patients à 14,6 mois (Stupp et al. 2005). Cependant, le GBM reste une tumeur uniformément fatale et il est donc important d’obtenir une meilleure connaissance de la biologie de ces tumeurs afin de développer de nouveaux traitements plus efficaces. L’avancée des connaissances a permis d’isoler à partir de ces tumeurs, les cellules qui seraient à l’origine des récidives : les cellules souches cancéreuses (CSC ou Glioma Stem Cells, GSC) (Vescovi et al., 2006). Les CSC de GBM expriment des niveaux très élevés de GLI1, ce qui indique que la voie Hh est active dans ces cellules. Le traitement avec la cyclopamine, inhibiteur de la voie Hh liant le co-récepteur SMO ou l’inactivation de GLI1 ou SMO par interférence de l’ARNm inhibe leur capacité à former à la fois des gliomasphères in vitro et des tumeurs orthotopiques in vivo, et ceci de manière additive ou synergique avec le TMZ (Clement et al. 2007, Bar et al. 2007). Cependant, l’action inhibitrice de la cyclopamine et de ses dérivés sur la voie Hh pourrait être toxique pour les cellules souches somatiques qui sont également Hh-dépendantes.
Chapitre III. Objectifs des travaux de cette thèse
72
Afin d'éviter cet inconvénient, l’équipe de « chimie des anticancéreux » de l’université de Poitiers (UMR/CNRS7285) dirigée par le Dr Sébastien Papot a modifié chimiquement la cyclopamine pour cibler son activité au micro-environnement des cellules tumorales (Hamon et al., 2010). Cette modification met en jeu l’activité de la β-glucuronidase retrouvée dans certaines tumeurs. En effet, à partir d’un certain stade, quand le cancer se développe, les cellules qui se trouvent au centre forment une zone nécrotique. Les constituants intracellulaires des cellules en nécrose et des phagocytes du système immunitaire, macrophages et polynucléaires neutrophiles, se retrouvent libérés dans le milieu extracellulaire, notamment la β-glucuronidase contenue normalement dans les lysosomes (Bosslet et al., 1995). La sélectivité d'une telle approche a déjà été démontrée in vivo avec plusieurs prodrogues glucuronylées qui présentent une efficacité thérapeutique supérieure à la chimiothérapie standard dans divers modèles de xénogreffe de tumeur (Kratz et al, 2008). Un niveau élevé de β-glucuronidase a été observé dans les GBM humains (Nygren, et al., 1997). Par conséquent, l'utilisation de prodrogues glucuronylées de la cyclopamine pourrait être efficace pour un traitement ciblé de ces tumeurs. Deux prodrogues glucuronylées de la cyclopamine ont été synthétisées par nos collaborateurs chimistes au cours de ma thèse. Le principe de ces prodrogues consiste à ajouter un acide glucuronique à la cyclopamine, d’une part pour neutraliser son activité et d’autre part, afin que ce résidu soit éliminé en présence de β-glucuronidase, au sein du microenvironnement tumoral, libérant ainsi la drogue active. La prodrogue 1a comprend un acide glucuronique, un espaceur constitué d’un groupement carbamate de nitrobenzylphenoxyle et la cyclopamine. La prodrogue 1b est similaire à 1a avec en plus sur l’espaceur un polyéthylène glycol plus un sucre permettant d’obtenir une prodrogue plus soluble. Dans des études récentes de mon équipe d’accueil et de l’équipe de chimie des anticancéreux, les prodrogues 1a et 1b ont été évaluée pour leur activité antiproliférative sur les cellules U87 après 5 jours de traitement. Lorsqu’elles sont incubées seules dans le milieu de culture, 1a et 1b n’affectent pas la viabilité des cellules, sauf à des doses élevées pour 1a (200 µM). Cependant, en présence de β-glucuronidase, les prodrogues
1a et 1b diminuent nettement la viabilité des cellules U87 avec des valeurs d’IC50 de 21 µM
et 24,5 µM proches de celle obtenue pour la cyclopamine (IC50 de 15,5 µM) (Hamon et al., 2010 ; Renoux et al., 2011).
Ainsi, un premier objectif qui m’a été confié dans le cadre de mes travaux de thèse, était de définir plus précisément la capacité de la prodrogue 1b à cibler efficacement la voie Hh, en particulier dans les CSC de glioblastome et d'en analyser les propriétés cytotoxiques chez des
Chapitre III. Objectifs des travaux de cette thèse
73
cellules C6 de GBM de rat, des astrocytes normaux et des coupes de tissu cérébral. La lignée cellulaire C6 a été choisie dans cette étude, car il a déjà été déterminé qu’elle (i) présente spontanément une population importante de CSC (Kondo et al, 2004), (ii) conduit au développement de GBM avec une zone nécrotique après injection dans le cerveau de rat (Morrone et al, 2004). Ces propriétés font de cette lignée cellulaire un modèle approprié pour l’évaluation in vivo de la prodrogue 1b.
2. Objectif 2 : analyse dans des cellules de GBM du «cross-talk » entre
les voies Hedgehog/Gli1 et PI3K/Akt et de leur régulation par le
système VIP-récepteurs
Une étude récente a montré l’implication du neuropeptide PACAP-38, analogue du VIP, dans la régulation de la voie Hh. L’effet du PACAP entraîne principalement l’augmentation du taux intracellulaire d’AMPc et l’activation de la PKA qui régule négativement cette voie Hh dans des cellules de médulloblastome (Lelièvre et al., 2008 ; Cohen et al., 2010). L’existence d’une interaction similaire entre le système VIP-récepteurs et la voie Hh dans des cellules de GBM n’a pas encore été étudiée. De plus, la majorité des travaux réalisés pour étudier l’implication du système VIP-récepteurs dans le développement des GBM, était focalisée sur son rôle dans la prolifération et la croissance des GBM. Une étude récente de mon équipe d’accueil a démontré l’implication du système VIP-récepteurs dans la migration et l’invasion in vitro de cellules de glioblastome humain, les cellules M059J et les cellules M059K (Cochaud et al., 2010). Ces 2 lignées issues d’un même GBM humain expriment le système VIP-récepteurs d’une façon différente. Le VIP ou le PACAP inhibent la migration rapide des cellules M059J, alors que deux antagonistes du VIP stimulent la migration basale faible des cellules M059K. Ces données ont donc indiqué que le VIP et le PACAP régulent la migration de ces cellules de GBM (Cochaud et al., 2010). Il a été montré par Wang et ses collaborateurs (2010) que l’inhibition de la protéine GLI1 dans les cellules U87 de GBM humain entraîne une diminution de la migration et de l’invasion de ces cellules. Ainsi, le deuxième objectif de mon projet de recherche a consisté à déterminer si la diminution de la migration induite par le système VIP-récepteurs dans les cellules M059J et M059K était retrouvée dans d’autres lignées de GBM, la lignée U87 de GBM humain ainsi que la lignée C6 de GBM de rat. De plus, il m’a été proposé d’approcher les voies de signalisation impliquées dans la régulation de la migration et de l’invasion de ces cellules de GBM par le
Chapitre III. Objectifs des travaux de cette thèse
74
système VIP-récepteurs. En particulier, mes travaux visaient à préciser les éventuelles interactions (« cross-talk ») entre la voie Hh, la voie PI3K/Akt et le système VIP-récepteurs. Ces mécanismes et leurs interactions ont été clairement impliqués dans le développement de nombreux types de cancers et en particulier des médulloblastomes qui dérivent comme les GBM du système nerveux (Kwiatkowska and Symons, 2013; Santoni et al., 2013 ; Stecca et al., 2007 ; Wang et al., 2010). Mes travaux ont donc consisté à évaluer le rôle de ces mécanismes régulateurs dans des cellules de GBM.
75
PRESENTATION
DES TRAVAUX
Chapitre IV. Présentation des travaux