Les neuropeptides VIP et PACAP

2.1. Les polypeptides de la famille du VIP

L'analyse de la structure du VIP (Mutt et Said, 1974) a montré qu’il présentait des homologies de séquence avec la famille des polypeptides apparentés à la sécrétine et au glucagon. Aujourd'hui, cette famille s'est élargie, elle inclut une dizaine de polypeptides (Tableau 2), dont le PACAP (pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide), le GRF (growth hormone-releasing factor), le PHI (peptide having N-terminal Histidine and C-

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terminal Isoleucine/Methionine et son homologue humain PHM) (Tatemoto and Mutt, 1981; Itoh et al, 1983), l’hélodermine, le GIP (gastric inhibitory polypeptide) et les GLP1 et 2 (glucagon-like peptide 1 et 2). Ces ligands endogènes partagent des propriétés communes (Couvineau and Laburthe, 2012) : (i) ils sont tous des peptides avec 27 à 44 résidus d'acides aminés, (ii) ils sont tous synthétisés et libérés par des cellules endocrines, des neurones et/ou des cellules immunitaires, (iii) ils présentent une configuration en hélice-α au niveau de la séquence commençant du résidu 6 jusqu'à l'extrémité C-terminale du peptide, (iiii) un motif structural commun nommé N-Cap est présent au niveau de l'extrémité N-terminale, (Neumann et al., 2008). De même que le VIP, le PACAP et les autres peptides sont impliqués dans de nombreuses régulations multifactorielles au sein de l'organisme.

2.2. Biosynthèse du VIP

Les premières études portant sur la localisation immunocytochimique du PHI chez le Rat, ont montré une colocalisation très fréquente du VIP et du PHI dans les tissus étudiés. De plus, des précurseurs biosynthétiques à la fois du VIP et du PHM ont été identifiées dans des tumeurs endocrines de type VIPome. Il avait alors été proposé par Christofides et ses collaborateurs que ces peptides pourraient résulter de la maturation d'un même précurseur peptidique (Christofides et al., 1982). Ceci a été confirmé par le clonage puis le séquençage d'un ADN complémentaire codant pour ce précurseur peptidique dans une lignée de neuroblastome humain NB-OK-1 (Itoh et al., 1983), puis dans le cortex de Rat. Ce précurseur peptidique commun, le pro-VIP de 17,5 kDa, dérive du prépro-VIP de 20 kDa contenant la séquence signal.

Le gène codant le VIP et le PHI/PHM s’étend sur 9 kpb. Il est composé de six introns et de sept exons dont 4 exons seulement participent à la synthèse protéique : les exons I, VII et VIII sont des régions non traduites. L'exon II code pour la séquence signal, alors que les exons IV et V codent respectivement pour le PHI/PHM et le VIP (Linder et al., 1987). L’exon III codant pour un peptide espaceur, qui semble important pour le clivage du VIP. Des techniques d'hybridation in situ ont permis de montrer que chez l'Homme, ce gène est localisé au niveau du bras long du chromosome 6 (locus 6q24).

La transcription du gène codant le VIP et le PHI/PHM est sous la dépendance complexe de facteurs de régulation. Certaines des régions spécifiques de l’ADN sur lesquelles ces facteurs interagissent ont été caractérisées. En effet, il a été identifié dans la région promotrice

Figure 24 : Biosynthèse des neuropeptides VIP, PHM, PACAP et PRP chez les Mammifères. Au niveau de

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en amont du gène, diverses séquences nucléotidiques notamment un élément de réponse à l’AMPc appelé CRE (cAMP response element) (Tsukada et al., 1987). Ce dernier régule la transcription du gène VIP/PHM après une stimulation avec l’AMPc ou sous l’effet d’esters de phorbols tels que le TPA (12-O-tetra-decanoylphorbol 13-acétate) et le PMA (phorbol-12- myritate-13-acétate) (Yamagami et al., 1988). Le PMA et le TPA induisent aussi l’expression du gène VIP/PHM grâce à une séquence TRE (TPA/PMA-responsive element) (Waschek et al., 1988) localisée en amont de sites STAT et AP1 (Hahm et Eiden., 1999). Des membres de la famille des cytokines, le CNTF (ciliary neurotrophic factor) et le LIF (leukemia inhibitory factor) induisent la transcription du gène codant pour le VIP par l'intermédiaire d'un élément de 180 pb appelé « cytokine response element » (CyRE) situé à environ 1300 bases du site d'initiation de la transcription (Symes et al., 1994 1995 et 1997). Il a été montré que le VIP lui-même active la transcription de son propre gène. Le PACAP aussi peut induire l’expression du VIP dans des cellules de neuroblastome NB-1. Le PACAP via PAC1 stimule les voies de signalisation de la protéine kinase A (PKA) et de la protéine kinase C (PKC), ce qui conduit à l’activation du facteur de transcription CREB (cAMP responsive element binding) qui peut se fixer sur l’élément CRE et activer le complexe c-fos et c-jun. Ces derniers stimulent la transcription du gène du VIP (Falktoft et al., 2009).

La maturation du précurseur du VIP et du PHI/PHM est assurée par une suite de clivages enzymatiques réalisés par des convertases au niveau de doublets d'acides aminés basiques de type lysine-lysine ou arginine-lysine, puis par une carboxypeptidase, et enfin par une amidation de l'extrémité C-terminale (Figure 24). Ces modifications varient selon le tissu ou l'espèce étudiés.

2.3. Biosynthèse du PACAP

C'est sur la base de sa capacité à stimuler l'adénylyl cyclase dans l'hypophyse de mouton que le PACAP-38 (polypeptide de 38 acides aminés) a été isolé en 1989 par Miyata et ses collaborateurs. Le PACAP-27 (polypeptide de 27 acides aminés) a été identifié par la suite dans le même tissu, où il est cependant présent en moindre quantité (Miyata et al., 1989). Les deux peptides partagent de fortes homologies de séquences avec le VIP (68% d’homologie avec le PACAP-27) (Arimura et al., 1992).

Le gène codant le PACAP-38, ainsi qu'un autre polypeptide de 29 acides aminés, le PRP (PACAP related peptide) dont la fonction est encore aujourd'hui inconnue, a été cloné chez le

Figure 25 : Organisation du gène du PACAP et de son ARNm. Les 5 exons correspondent aux rectangles en vert et sont numérotés. Les régions non traduites des exons 1 et 5 sont représentées par les traits en pointillés bleu. Les domaines codant pour le peptide signal (PS), le PRP et le PACAP sont hachurées en rouge. La localisation des sites de fixation de facteurs de transcription potentiels et de polyadénylation sont indiqués sur le gène et l’ARNm respectivement. AP1, activator protein 1 ; NRSLE, neural-restrictive silencer-like element ; TRE, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate response element ; TS, site d’initiation de la transcription ; TTF, thyroïd transcription factor (D’après Vaudry et al., 2009).

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Mouton, chez l'Homme et chez le Rat. Sa séquence code pour un polypeptide précurseur, le prépro-PACAP, comportant 176 acides aminés (175 chez le rat), et présentant une masse moléculaire de 19,5 kDa (Ogi et al., 1990 ; Hosoya et al., 1992). Le gène comporte 5 exons et 4 introns. Le PACAP-38 est codé par un seul exon (l'exon V). Chez l'Homme, ce gène est situé sur le bras court du chromosome 18 (locus 18p11) (Hosoya et al., 1992, Okhubo et al., 1992) .

Le gène PACAP possède plusieurs sites d’initiation de la transcription et des sites de polyadénylation (Yamamoto et al., 1998, Miyata et al., 2000) (Figure 25). Comme pour le gène du VIP, de nombreuses séquences régulatrices ont été identifiées au niveau du promoteur telles qu’une séquence TRE, deux séquences CRE, une boite de GATA, deux sites de liaison pour le transactivateur du GHF-1 (growth hormone factor-1) qui régule l’expression tissu-spécifique de l’hormone de croissance, et un domaine riche en CT précédé d’une boîte GC reconnue par le facteur de transcription Sp1 (Bodner et al., 1988, Dolle et al., 1990, Castrillo et al., 1991, Hosoya et al., 1992, Suzuki et al., 1994, Hashimoto et al., 2000). Dans les cellules C6 de GBM de rat, il a été montré que le TTF-1 (thyroïd transcription factor) se lie au gène du PACAP et active son promoteur d'une manière dose-dépendante (Kim et al., 2002). De plus, il a été montré que le PACAP peut aussi réguler l’expression de son propre gène dans les cellules IMR-32 de neuroblastome humain (Suzuki et al., 1994).

Le processus de maturation du PACAP est similaire à celui du VIP. En effet, plusieurs clivages par des convertases du prépro-PACAP, suivis de l’action d’une carboxypeptidase et de l’amidation C-terminale permettent la maturation du PACAP-38, du PRP ou d’autres formes (Figure 24). Le PACAP-27 dérive du PACAP-38 après un processus post- traductionnel de protéolyse du PACAP-38 au niveau de deux résidus basiques suivi d’une amidation (Miyata et al., 1990).