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4. OBJECTIFS DE LA THÈSE
Nous avons montré que l’AChE est une enzyme adaptée à une étude de dynamique structurale des protéines. Nous avons également souligné la place qu’occupe l’AChE au sein de préoccupations de santé publique majeures. Ainsi, mieux comprendre le fonctionnement de l’AChE en établissant les relations qui existent entre sa structure, sa dynamique et son activité biologique pourrait non seulement ouvrir de nouvelles perspectives quant à l’étude de la dynamique structurale d’autres protéines, mais pourrait également contribuer à élaborer les traitements que nécessitent les troubles liés à l’inhibition de cette enzyme, qu’ils soient d’ordre pathologique ou accidentel.
La grande diversité des molécules pouvant se lier à l’AChE représente pour nous un avantage de taille dans le cadre d’une étude de dynamique structurale. Nous avons ainsi pu, indépendamment, nous intéresser à différentes questions biologiques ou pharmacologiques. En outre, la diversité des molécules utilisées nous a permis de nous focaliser sur différentes régions de l’enzyme.
Les objectifs de cette thèse étaient doubles. D’une part, nous souhaitions améliorer la compréhension des mécanismes de fonctionnement de l’AChE, notamment lorsqu’elle est inhibée par des OP, des toxines, ou des molécules potentiellement anti-Alzheimer. Les molécules que nous avons choisies appartiennent à ces trois catégories. Sur le plan pharmacologique, ce travail vise à permettre l’élaboration d’antidotes plus efficaces contre les intoxications aux OP et à aider à la conception de nouveaux médicaments utiles à la lutte contre la MA. Sur le plan biologique, nous avons également cherché à mettre en évidence la communication allostérique suspectée entre le CAS et le PAS. D’autre part, nos travaux ont visé à développer de nouvelles méthodes pour étudier la dynamique de l’AChE. Nous avons ainsi participé à deux projets de cristallographie et initié la mise en place d’une méthode permettant la caractérisation de la dynamique lente de l’AChE. L’approche structurale a été réalisée par cristallographie des protéines aux rayons X (cf. partie 5.1). L’approche dynamique a été rendue possible par des techniques spectroscopiques, notamment la mesure du temps de vie de phosphorescence d’un ligand luminescent de l’AChE.
47 La cristallographie aux rayons X nous a permis de résoudre la structure de la TcAChE en complexe avec deux molécules potentiellement anti-Alzheimer synthétisées par des chimistes de l’université de Sienne, le NF766 et le NF1056. Les anti-Alzheimer de seconde génération se liaient jusqu’alors uniquement au niveau des résidus du CAS ou du PAS. Nos résultats révèlent l’importance de nouveaux points d’ancrage propres à augmenter le potentiel de ces molécules dans leur rôle double d’inhibiteur de l’activité cholinestérasique et d’inhibiteur de la promotion de la fibrillation d’Aβ (partie 6.1). Ces travaux font suite à un projet auquel nous avons participé : la résolution de la structure d’un complexe de la TcAChE avec un anti-Alzheimer de seconde génération, le NF595 [Colletier, Sanson, Nachon, Gabellieri, Fattorusso, Campiani & Weik 2006a] (annexe 1). La structure, qui révèle un changement conformationnel de grande amplitude du Trp279, le résidu principal du PAS au niveau duquel se lie le NF595, suggère de prendre en compte les conformations minoritaires d’une enzyme dans la conception d’un médicament pour en optimiser l’action.
L’AB1, extrêmement cancérigène, dérive d’une mycotoxine présente dans certaines cultures des régions chaudes et humides. En outre, l’AB1 se lie spécifiquement au niveau du PAS : nous avons participé à une étude visant à mettre au point un biosenseur, basé sur l’inhibition de l’AChE par l’AB1, capable de détecter les traces d’AB1 dans une culture [Hansmann, Sanson, Stojan, Weik, Marty & Fournier 2009] (annexe 2). A cette occasion nous avons obtenu les structures de la TcAChE en complexe avec l’AB1 (partie 6.3). Nous montrons ici les seules structures disponibles de la TcAChE en complexe avec un ligand du PAS dans les deux groupes d’espace les plus fréquemment rencontrés dans le cas de structures de TcAChE (P3121 et P212121). Ces structures ont été l’occasion de mettre en lumière des artéfacts que l’on peut rencontrer en cristallographie des protéines, et qui peuvent biaiser l’interprétation des données. Nos travaux décrivent la procédure suivie pour éviter ce problème.
Nous avons tiré profit de la phosphorescence de l’AB1 : nous avons utilisé celle-ci comme marqueur phosphorescent spécifique du PAS (partie 6.4). Nous avons ainsi pu avoir accès à la dynamique lente du PAS de la TcAChE dans une gamme de températures cryogéniques comprises entre 100 et 240 K. Nous pouvons alors préciser, ou du moins confirmer, la température la plus propice à une expérience de cristallographie cinétique contrôlée par la température. Nous avons en effet pu participer à deux projets de ce type, l’un basé sur l’utilisation de produits en cage [Colletier, Royant, Specht, Sanson, Nachon,
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Masson, Zaccai, Sussman, Goeldner, Silman, Bourgeois & Weik 2007] (annexe 3) et l’autre sur la radiolyse d’un analogue de substrat [Colletier, Bourgeois, Sanson, Fournier, Sussman, Silman & Weik 2008] (annexe 4).
Enfin, nous avons résolu les structures des conjugués de TcAChE avec le soman dans les étapes principales de l’inhibition (partie 6.2). Contrairement à l’AB1 et aux anti- Alzheimer, le soman se lie spécifiquement au niveau du CAS. C’est un OP qui aboutit à un vieillissement rapide de l’AChE et contre lequel tous les antidotes disponibles sont inefficaces. Alors que la forme vieillie du conjugué avait été résolue par co-cristallisation de TcAChE et de soman [Millard 1999b], nous avons été en mesure d’obtenir la structure des formes non-vieillie et vieillie par trempage de cristaux de TcAChE dans une solution de soman. Nous avons également cherché à expliquer le manque d’efficacité du réactivateur le plus utilisé, le 2-PAM, dans le cas d’une inhibition de l’AChE par le soman. La structure d’un complexe ternaire TcAChE vieillie/soman/2-PAM a ainsi été résolue. Elle montre que l’orientation du 2-PAM n’est pas favorable à la réactivation.
Dans la suite (partie 5), nous décrirons les méthodes et les outils mis en œuvre pour mener à bien nos travaux. La cristallographie des protéines aux rayons X sera présentée dans les grandes lignes. La cristallographie cinétique sera abordée à cette occasion. Nous décrirons ensuite la technique spectroscopique mise en oeuvre au cours de cette thèse. Les résultats (partie 6) sont présentés sous la forme de quatre articles (parus, soumis ou en préparation) rédigés en anglais. Nous discuterons alors l’ensemble des résultats obtenus au cours de cette thèse et dégagerons des perspectives de nos travaux avant de conclure (partie 7).
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