Objectifs et stratégie de notre étude du procédé PISA pour le système PNAM/PnBA

Dans notre étude, nous nous sommes concentrés sur l’obtention par PISA de nanoparticules sphériques présentant des clusters peptidique Raft(cRGD)4 en périphérie (à l’extrémité α des blocs hydrophiles). Pour cela, nous avons pu nous baser sur des premiers essais de polymérisation en dispersion réalisés par Maël Bathfield pour la synthèse de nanoparticules proches de celles que nous souhaitons obtenir, mais fonctionnalisées par des sucres à l’extrémité de la totalité des cheveux hydrophiles41. Notre objectif est d’obtenir, de manière reproductible, des nanoparticules de diamètre contrôlé, entre 20 et 200 nm avec une faible dispersité. Ceci est en effet important afin d’obtenir une bonne reproductibilité lors des évaluations biologiques. Cette gamme de tailles devrait être bien adaptée pour bénéficier de l’effet EPR et éventuellement pour être internalisée dans les cellules lors des évaluations biologiques121-123. Les tailles les plus faibles (20 – 50 nm) pourraient également servir à réaliser une comparaison avec les conjugués linéaires.

Notre stratégie en deux étapes consiste tout d’abord à synthétiser, par polymérisation RAFT, des homopolymères PNAM fonctionnalisés à leur extrémité α par le Raft(cRGD)4, grâce à la synthèse d’un nouvel agent de transfert fonctionnalisé, l’ATC-Raft(cRGD)4 (Figure II-27). Cette approche d’introduction du peptide « pré-polymérisation » devrait permettre d’avoir un excellent taux de fonctionnalisation de l’extrémité α des chaines PNAM par le Raft(cRGD)4 tout en conservant la fonction dithiobenzoate de l’extrémité ω nécessaire à la seconde étape de la synthèse par le procédé PISA. Pour cette dernière, les nanoparticules n’ayant pas besoin d’avoir l’ensemble des cheveux fonctionnalisés, un mélange de macroATC constitué de PNAM avec et sans cluster Raft(cRGD)4 est envisagé.

Figure II-27 : Représentation schématique de la voie de synthèse des nanoparticules envisagées.

La subdivision de la synthèse en deux étapes permet de mieux contrôler son déroulement en introduisant des purifications et des caractérisations intermédiaires. Ainsi, après le couplage, l’ATC-Raft(cRGD)4 est purifié et caractérisé, tout comme le PNAM fonctionnalisé par le Raft(cRGD)4 après la polymérisation. De plus, comme la polymérisation de NAM avec l’ATC-Raft(cRGD)4 n’atteint pas forcement une conversion totale, il est préférable d’éliminer les éventuels restes de monomère NAM pour éviter qu’ils perturbent le bon déroulement du procédé PISA en copolymérisant avec le monomère nBA.

II.3.

Méthodologie de caractérisation du procédé PISA dans le cas du système

PNAM/PnBA

L’optimisation de la synthèse de nanoparticules et l’étude de ses principaux paramètres ont été réalisés uniquement avec des macroATC de type PNAM « classiques », porteurs d’une fonction tert-butyl à leur extrémité α. En effet, le cluster Raft(cRGD)4 étant difficile à produire en grande quantité, il était impossible d’obtenir suffisamment de conjugué Raft(cRGD)4-PNAM pour réaliser toute la mise au point de la synthèse des nanoparticules par le procédé PISA. D’autre part, comme le conjugué Raft(cRGD)4-PNAM est seulement soluble dans un mélange eau/acétonitrile, l’optimisation a été effectuée dans un mélange eau/acétonitrile (50/50 : v/v). Dans cette partie II.3. sont présentées les différentes méthodes analytiques qui ont permis d’étudier les principaux paramètres du procédé PISA appliqué au système PNAM/PnBA.

+ ^Couplage NAM Auto-assemblage induit par polymérisation Polymérisation RAFT SEDB Raft(cRGD)4 nBA Fluorophore hydrophobe

macroATC sans Raft(cRGD)4

macroATC porteur du Raft(cRGD)4

ATC-Raft(cRGD)4

macroATC porteur du Raft(cRGD)4

1èreétape : synthèse d’un nouvel ATC + polymérisation RAFT en milieu continu

II.3.1. Descriptif visuel du milieu réactionnel pendant un essai PISA

De manière générale, l’ensemble des étapes présentées est reproductible et permet de confirmer un déroulement convenable du procédé PISA dans le cas du système PNAM/PnBA.

Initialement et sans agitation, le milieu est biphasique avec une phase inférieure (eau/acétonitrile) orange contenant le macroATC PNAM et l’amorceur ainsi qu’une faible proportion de nBA (solubilité de 2 g.L-1 dans l’eau), surmontée par une phase organique incolore (moins dense) constituée de nBA et d’acétonitrile. Le milieu est ensuite placé sous agitation (850 rpm) à 80°C (t0) ce qui induit une phase dispersée orangée non stable (qui se resépare en deux phases si l’agitation est interrompue). Après quelques minutes (environ 10 min), le milieu devient moins trouble bien que la polymérisation n’ait pas encore débutée (d’après analyses RMN 1H). Après 20 à 30 min, le milieu redevient plus trouble (orangé) indiquant que la polymérisation a commencé (d’après analyses RMN 1H). A partir de cette étape, la dispersion devient stable et de plus en plus rose puis tend vers blanc laiteux à mesure que la conversion du nBA augmente.

II.3.2. Détermination de la conversion en nBA

La RMN 1H est utilisée pour déterminer la conversion en nBA lors du procédé PISA. Périodiquement, un échantillon du milieu réactionnel est prélevé et placé dans l’azote liquide pour interrompre la polymérisation. Il est ensuite dilué dans du chloroforme deutéré, très bon solvant du copolymère à bloc PNAM-b-PnBA et du nBA. Le premier prélèvement qui sert de référence pour la détermination de la quantité de nBA initiale, est réalisé 10 min après t0. Avant, le prélèvement ne serait pas représentatif du milieu dispersé.

Trois méthodes permettent de déterminer la conversion en nBA (Figure II-28).

Figure II-28 : Spectre RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) représentatif enregistré pour un prélèvement lors d’un essai PISA dans un mélange eau/acétonitrile (50/50 : v/v). Les chiffres suivis de la lettre P correspondent aux protons des unités nBA du bloc PnBA.

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 1 2 1 bis 6 et 6 P CHCl3 trioxanne 4’ 1’ 3 4 et 4 P 5 et 5P 4’ ^4’ 3’ 2’ 1’ 1’ 5’ ^6’ 6’ 4’ 5’ 7’ 4’ 2’ 3’ acétonitrile 3 P H20 ₁ 2 3 4 5 6 1 bis 5’, 6’, 7’ 1 P 2 P 1’

La première consiste à comparer les intégrales de deux pics correspondants aux mêmes protons du nBA, d’une part sur les unités nBA déjà polymérisées et d’autre part sur le monomère nBA résiduel. Par exemple, les pics entre 3,9 et 4,2 ppm correspondant au CH2 en α de l’atome d’oxygène du nBA (2 protons notés 3 sur la figure II-28) semblent les plus judicieux car ils sont relativement bien isolés.

Les deux autres méthodes permettent de suivre la diminution des intégrales des protons vinyliques (notés 1 et 2 sur la figure II-28) en prenant comme référence interne, soit des protons du macroATC PNAM (massif large entre 3 – 3,9 ppm), soit les 6 protons du trioxanne à 5,1 ppm (référence ajoutée au milieu réactionnel initial).

Les trois méthodes aboutissent à des résultats très proches, toutefois la méthode utilisant les protons vinyliques et le trioxanne a été privilégiée car les pics correspondants sont très bien isolés et permettent une intégration plus facile et plus précise.

Il faut souligner que contrairement aux nanoparticules non réticulées, les nanoparticules réticulées ne sont pas totalement dissoutes après dilution de l’échantillon dans le chloroforme deutéré. Ainsi, les blocs PnBA du cœur figé ne seront donc pas visibles en RMN 1H. Il est donc préférable de suivre les protons vinyliques du monomère pour la détermination de la conversion.

Remarque : Pour ces analyses RMN 1H, il faut noter qu’une très faible quantité d’eau(inférieure à 15 µL)issue de l’échantillon du milieu de polymérisation est présente au dessus du chloroforme deutéré (600 µL) (dans le tube RMN) ce qui peut induire une légère incertitude sur les mesures. En effet, cette phase aqueuse peut éventuellement retenir des composés solubles en milieu aqueux (exemple du PNAM, aussi bien soluble dans CDCl3 que dans l’eau) qui n’apparaitront pas sur l’analyse RMN. Il est toutefois raisonnable de penser que cette quantité d’eau est suffisamment faible par rapport au très large excès de chloroforme pour que cette incertitude soit négligeable. Par conséquent, nous n’en avons pas tenu compte pour la détermination des conversions du nBA.

II.3.3. Détermination de la taille des nanoparticules

Comme notre objectif principal était de contrôler la taille des nanoparticules, nous nous sommes donc focalisés sur plusieurs techniques permettant d’accéder à ce paramètre. Le diamètre hydrodynamique moyen en nombre des nanoparticules a été déterminé par diffusion quasi-élastique de la lumière (QELS) et par microscopie électronique à transmission (MET) (à partir de dilutions aqueuses et en réalisant des statistiques sur plusieurs mesures).

Le tableau suivant résume les principaux avantages/inconvénients de ces techniques de caractérisation de la taille des nanoparticules.

Techniques Avantages Inconvénients

QELS

 Analyse en solution

 Donne accès à des données statistiques  Simple d’utilisation

 Utilisable en routine pour un grand nombre d’échantillons

 Possibilité de faire varier la température et la composition de la phase continue

 Donne seulement accès au rayon

hydrodynamique de la nanoparticule (pas de distinction entre cœur et couronne)  Utilise un modèle de particules solides non

chevelues (latex de polystyrène)

MET

 Visualisation des nanoparticules

 Possible distinction entre cœur et couronne des nanoparticules

 Relativement complexe à mettre en œuvre  Nanoparticules séchées sur une grille  Favorise la coalescence des nanoparticules  Non utilisable en routine

CryoMET

 Morphologie de surface proche de celle en solution (figé dans la glace)

 Visualisation des nanoparticules

 Possible distinction entre cœur et couronne des nanoparticules

 Très complexe à mettre en œuvre  Non utilisable en routine

La technique QELS permet de réaliser facilement un grand nombre d’analyses tout en restant en solution. De plus, elle permet d’accéder à des résultats statistiques, très importants pour ce type de caractérisation où les composés ne sont pas monodisperses. Toutefois, la détermination du diamètre hydrodynamique (Dh) des nanoparticules se base sur un modèle de particules solides non chevelues. Cette technique fournit donc une valeur de taille d’une nanoparticule chevelue sans doute légèrement sous-estimée (Figure II-29).

Figure II-29 : Représentation schématique de la détermination de la taille d’une nanoparticule chevelue (par QELS selon différents modèles). A) Cas idéal où la correspondance est parfaite. B) Le diamètre hydrodynamique (QELS) correspond à la partie la plus dense de la nanoparticule et sous-estime la taille réelle. C) Le diamètre hydrodynamique (QELS) englobe une partie du solvant qui se déplace avec la nanoparticule et sur-estime la taille réelle.

La MET a l’avantage de permettre une visualisation des nanoparticules et ainsi de distinguer le cœur de la couronne. L’observation nécessite toutefois de sécher l’échantillon ; par conséquent, les nanoparticules ne sont pas dans les mêmes conditions que lorsqu’elles sont hydratées en solution. Cette nuance peut par exemple influer sur la taille de la couronne. On peut raisonnablement imaginer que les cheveux hydrophiles ont plutôt tendance à être déployés en solution aqueuse, alors que dans les conditions de la MET, ils se replient sur le cœur. Ainsi, l’épaisseur de la couronne hydrophile obtenue d’après les clichés de MET peut être plus faible qu’en solution. De plus, les nanoparticules ayant un cœur mou (faible Tg du PnBA), elles ont tendance à coalescer (Figure II-36, C) pendant le séchage (ou après une exposition prolongée au faisceau

Cas idéal Taille sous-estimée Taille sur-estimée

C) B)

d’électrons), ce phénomène s’accentuant avec l’augmentation du diamètre du cœur des nanoparticules. Les observations de ce type de nanoparticules chevelues par MET sont donc très délicates.

La CryoMET pourrait pallier à ces problèmes, mais il s’agit d’une technique encore plus complexe qu’il est difficile d’utiliser en routine surtout pour un grand nombre d’échantillons.

Par conséquent, les analyses QELS ont été privilégiées pour la détermination de la taille des nanoparticules dans la suite de notre étude.

II.3.4. Contrôle de la copolymérisation à blocs

De manière complémentaire aux analyses de taille des nanoparticules, il serait également informatif de suivre le contrôle de la copolymérisation à blocs.

Les nanoparticules non réticulées peuvent en effet être totalement solubilisées dans un bon solvant des deux blocs (comme le chloroforme ou le DMF). Après évaporation de l’eau et de l’acétonitrile, éventuellement une précipitation du polymère (pour éliminer le nBA résiduel), l’analyse des copolymères à blocs par CES pourrait nous renseigner sur leur masse molaire, leur dispersité et sur la présence de PNAM résiduel (« blocking efficiency »), et donc sur le contrôle de la polymérisation.

Cependant, ces caractérisations par CES présentent plusieurs difficultés liées à la purification des échantillons (évaporation de l’eau, précipitation délicate, possible polymérisation spontanée du nBA lors du séchage des échantillons) et à l’analyse des masses molaires des copolymères à blocs. De plus, la polymérisation de nBA est connue pour donner lieu à des réactions de transfert au polymère, surtout lors de polymérisation en masse comme c’est le cas dans le cœur des micelles.

Par conséquent, nous n’avons pas réalisé d’étude approfondie dans ce sens au cours de ces travaux, mais cela pourrait faire l’objet d’analyses complémentaires à l’avenir.