L’objectif de ce projet est donc d’obtenir des molécules qui vont décroitre le niveau de surproduction de TNFα (et non pas l’inhiber totalement) dans l’optique de réduire les processus physiopathologiques liés à l’inflammation et aux douleurs neuropathiques, sans affecter de façon dramatique le système immunitaire, et avec une activité possible à long terme. Il est important de préciser qu’il ne s’agit pas d’inhibiteurs des récepteurs du TNFα, mais d’inhibiteurs de la cascade conduisant à la surproduction de TNFα membranaire et/ou soluble (Figure 10).
Figure 10. Exposition des monocytes humains aux lipopolysaccharides (LPS) : de l’activation de TLR4 par LPS jusqu’à la production de TNFα (et IL1β) solubles
Le point de départ du projet repose sur l’identification de petites molécules à l’aide d’un criblage cellulaire réalisé par la plate
Strasbourg, UMS 3286), comparable à une «
perturbation est engendrée à l’entrée de la cellule, et on observe l’effet à la sortie du système étudié. Dans cet exemple, les lipopolysaccharides (LPS) sont mis en contact avec des cellules monocytaires sanguines humaines afin de pr
se traduit par une augmentation de la production des cytokines pro
Une mesure des concentrations de ces cytokines solubles permet de quantifier l’effet de la perturbation. Ce test présente l’avantage de suivre une série d’événements moléculaire
système complexe (la cellule), car elle contient toute la «
ADN, ARN…). En revanche, les protéines cibles induisant l’effet physiol
pas être identifiées par ce processus. Cependant, un hit identifié et validé par ce test est particulièrement intéressant et mérite une première évaluation pharmacologique
2. 1. Description du test cellulaire
Le test est basé sur l’utilisation de monocytes humains (peripheral blood monocyte cells, PBMCs) de volontaires sains (fournisseur : Etablissement Français du Sang, Strasbourg). Ces cellules sont exposées à un stress avec des lipopolysaccharides (LPS), ce qui provoque une
avec production de cytokines, dont le TNFα et l’ test Elisa utilisant des anticorps anti
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Le point de départ du projet repose sur l’identification de petites molécules à l’aide d’un criblage -forme PCBIS (Plateforme de Chimie Biologique Intégrative de Strasbourg, UMS 3286), comparable à une « boîte noire » (Figure 10). En effet,
perturbation est engendrée à l’entrée de la cellule, et on observe l’effet à la sortie du système étudié. Dans cet exemple, les lipopolysaccharides (LPS) sont mis en contact avec des cellules monocytaires sanguines humaines afin de provoquer une réponse inflammatoire. Cette inflammation se traduit par une augmentation de la production des cytokines pro-inflammatoires
Une mesure des concentrations de ces cytokines solubles permet de quantifier l’effet de la e test présente l’avantage de suivre une série d’événements moléculaire
système complexe (la cellule), car elle contient toute la « machinerie cellulaire » (enzymes, protéines, ADN, ARN…). En revanche, les protéines cibles induisant l’effet physiologique recherché ne peuvent pas être identifiées par ce processus. Cependant, un hit identifié et validé par ce test est particulièrement intéressant et mérite une première évaluation pharmacologique
Description du test cellulaire
sur l’utilisation de monocytes humains (peripheral blood monocyte cells, PBMCs) de : Etablissement Français du Sang, Strasbourg). Ces cellules sont exposées à un stress avec des lipopolysaccharides (LPS), ce qui provoque une réponse inflammatoire avec production de cytokines, dont le TNFα et l’IL1β (interleukine 1β), qui sont lib
test Elisa utilisant des anticorps anti-TNFα et anti-Il1β, il est possible de déterminer un pourcentage
Figure 11. Schématisation du test cellulaire
Le point de départ du projet repose sur l’identification de petites molécules à l’aide d’un criblage forme de Chimie Biologique Intégrative de ). En effet, lors de ce test, une perturbation est engendrée à l’entrée de la cellule, et on observe l’effet à la sortie du système étudié. Dans cet exemple, les lipopolysaccharides (LPS) sont mis en contact avec des cellules ovoquer une réponse inflammatoire. Cette inflammation inflammatoires TNFα et IL1β. Une mesure des concentrations de ces cytokines solubles permet de quantifier l’effet de la e test présente l’avantage de suivre une série d’événements moléculaires sur un » (enzymes, protéines, ogique recherché ne peuvent pas être identifiées par ce processus. Cependant, un hit identifié et validé par ce test est particulièrement intéressant et mérite une première évaluation pharmacologique in vivo.
sur l’utilisation de monocytes humains (peripheral blood monocyte cells, PBMCs) de : Etablissement Français du Sang, Strasbourg). Ces cellules sont réponse inflammatoire (interleukine 1β), qui sont libérées. A l’aide d’un éterminer un pourcentage
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d’augmentation du taux basal de cytokine. Dans un deuxième temps, les cellules exposées aux LPS sont mises en contact avec les molécules (test à 10 µM, n=2) de la chimiothèque. Après un temps d’incubation de 24h, une mesure des deux cytokines résiduelles permet de mesurer pour chaque composé l’inhibition de production de ces cytokines à 10 µM. En parallèle, un test de viabilité cellulaire permet de rejeter les molécules touvées actives du fait de leur effet cytotoxique (Figure 11). Dans un deuxième temps, une IC50 (concentration provoquant 50% d’inhibition de la production de TNFα) est déterminée à partir d’effets inhibiteurs mesurés à différentes concentrations de molécule testée.
2.1.1. Présentation de la chimiothèque
L’équipe du Laboratoire d’Innovation Thérapeutique a constitué une chimiothèque de molécules contenant essentiellements des nouvelles entités chimiques (NEC). Ces molécules (environ 6500) sont issues de la chimiothèque patrimoine et chimiothèque interne de l’équipe du Dr. Jean-Jacques Bourguignon et regroupant toutes les molécules synthétisées dans le cadre de projets pharmacochimiques (ligands de récepteurs, inhibiteurs d’enzymes) ou de projets de méthodologie chimique (construction d’hétérocycles). De ce fait ces molécules présentent une très forte diversité structurale et sont dans la grande majorité des cas des hétérocycles diversements substitués avec un caractère drug-like très marqué. De plus 1000 médicaments, ou candidats cliniques issus de la chimiothèque Prestwick (≈700), et notre propre sélection de médicaments non inclus dans la chimiothèque Prestwick (≈300), ont permis de compléter notre chimiothèque. L’ensemble de cette chimiothèque a été criblée à 10 µM en vue d’identifier des hits anti-TNFα et/ou anti-IL1β.
2.1.2. Criblage et validation des hits
Ces hits issus du criblage primaire ont été validés (n=2). Le criblage a été effectué à l’aveugle, sans connaissance des structures des hits. La pertinence du criblage est supportée par le fait que nous avons pu retrouver plusieurs hits appartenant à des classes de composés inhibiteurs de production de TNFα (dits anti-TNFα) déjà connus dans la littérature.
1- iPDE4
Nous avons identifié plusieurs inhibiteurs de PDE4 (Figure 12) comme composés anti-TNFα, en particulier des références connues telles que le rolipram, la papavérine et le tofisopam. Ce résultat concernant la classe des iPDE4 était connu dans la littérature69 mais nous a permis de valider ce test.
37 2- Stéroïdes
Le test a également permis d’isoler un certain nombre de stéroïdes connus (Figure 13) pour leurs propriétés anti-TNFα à l’origine de leurs propriétés anti-inflammatoires (hydrocortisone, dexaméthasone, béthaméthasone, etc).
Figure 13. Inhibiteurs de stéroïdes
3- Phénéthylamines
Enfin, nous avons également identifié au cours du criblage une série de phénéthylamines (Figure 14), qui sont en fait des agonistes β2 noradrénergiques (fénotérol, mébévérine, clenbutérol, ritodrine, dobutamine, terbutaline). L’efficacité des traitements des douleurs neuropathiques observées avec les agonistes β2 est bien documentée aujourd’hui dans la littérature et se traduit par une inhibition de la surexpression de TNFα observée en proximité des lésions nerveuses à l’origine des neuropathies (cf page 64).
Figure 14. Agonistes β2 noradrénergiques
4- Antidépresseurs tricycliques
De nombreux antidépresseurs tricycliques (Figure 15) ont été identifiés comme hits anti-TNFα (amitriptyline, désipramine, doxépine, etc). Ce résultat est connu dans la littérature et sera discuté dans le paragraphe 7. 1.
Ainsi une analyse des résultats de ce criblage faite par classe chimique mais aussi par classe pharmacologique aurait permis de découvrir que les inhibiteurs de PDE4, les agonistes β2 et les inhibiteurs de recapture des amines biogènes (tricycliques) inhibent la production de TNFα.
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Figure 15. Antidépresseurs tricycliques
En conclusion, le fait de retrouver pour ce test de criblage des anti-TNFα connus comme substances de référence valide complètement la pertinence du test de criblage dans sa capacité à permettre la découverte de nouvelles classes pharmacologiques (ou chimiques) de composés "anti-TNFα".
2. 2. Description des hits validés
Un aspect important pour la sélection des hits est le niveau d’efficacité d’inhibition minimale observé à 10 µM. Nous avons évoqué les risques associés à des composés trop puissants (IC50 proche du nM), capables à très faible concentration de non seulement bloquer la surproduction de TNFα en le ramenant au taux basal, mais d’inhiber 100% du TNFα produit, ce qui reviendrait à neutraliser tous les rôles physiologiques dans lesquels le TNFα est impliqué, en particulier dans le système immunitaire.
Etant donné que le TNFα est impliqué dans le système immunitaire, nous avons retenu les hits ayant i) une inhibition comprise entre 30 et 50% dans la plage 1-10 µM ; ii) une courbe assez « plate » ; et iii) qui inhibe uniquement la surproduction de TNFα (retour au taux basal, Figure 16 courbe rouge). A l’opposé, nous avons rejeté les hits ayant i) une activité trop puissante (IC50 <50 nM), ii) une courbe d’inhibition « abrupte » et iii) qui inhibe la totalité du TNFα, car cela provoquerait des effets secondaires trop importants (courbe bleue).
Figure 16. Sélection des hits suivant la courbe des IC50
Finalement, ce criblage a permis de retenir une quarantaine de NEC capables d’inhiber la surproduction de TNFα in vitro. Parmi ces composés, 2 hits ont été retenus dans le cadre de ma thèse (Figure 17): le RF 1431 (1b), qui fera l’objet de ce chapitre ; et le RF 0913 (2a) qui sera traité dans le chapitre suivant. Les courbes d’inhibitions du TNFα de ces 2 composés ont le profil recherché. Ces produits présentent également un début de sélectivité vis-à-vis d’IL1β. Ces 2 hits sont des dérivés d’amidines pour lesquels l’équipe est reconnue pour son savoir-faire en chimie hétérocyclique.