4. 1. Synthèse des dérivés de pyrimidines
4.1.1. Synthèse des dérivés de 2-aminopyrimidines diversement substitués en position 4
La synthèse des dérivés du RF 1431 (1b) met en jeu les pyrimidines dihalogénées 16a-b. Une première réaction de formation de liaison C-C permet d’introduire l’aromatique en position 4 ou 5. Selon la nature du substituant, 3 différentes conditions ont été développées (Schéma 1 et Tableau 2).
a
RB(OH)2 (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (5 mol%), KF (2.0 equiv.), MeOH, 120 °C, 20 mins, µM; bRB(OH)2 (1.0 equiv.), PdCl2(PPh3)2 (6 mol%), Na2CO3 (3.0 equiv.), THF:H2O (1:1), 80 °C, 16h; cR(CH2)nMgCl (2.1 equiv.), Fe(acac)3 (5 mol%), THF, - 78 à 25 °C, 16h;
d
RNH2 (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100 °C, 16h ; eROH (2.5 equiv.), NaH (2.8 equiv.), DMF, 100 °C, 16h.
46
Rendements (%)
Entrée Cpsé X Position R X n Het Méthode 17-18 1, 10-11,
13-14 1 1a / / H NH 0 4-piperidino / nr 73 2 1b 4-Cl 4 Ph NH 0 4-piperidino A 72 86 3 1f 4-Cl 4 2-OMePh NH 0 4-piperidino A 68 57 4 1g 4-Cl 4 2-ClPh NH 0 4-piperidino A 41 70 5 1h 4-Cl 4 3-OMePh NH 0 4-piperidino A 70 69 6 1i 4-Cl 4 3-ClPh NH 0 4-piperidino A 70 78 7 1j 4-Cl 4 4-OMePh NH 0 4-piperidino A 73 86 8 1l 4-Cl 4 4-ClPh NH 0 4-piperidino A 43 66 9 1m 4-Cl 4 4-FPh NH 0 4-piperidino A 71 79 10 1n 4-Cl 4 4-CF3Ph NH 0 4-piperidino A 46 77 11 1o 4-Cl 4 4-OCF3Ph NH 0 4-piperidino A 48 88 12 1p 4-Cl 4 2-Cl-4-OMePh NH 0 4-piperidino A 39 66 13 1q 4-Cl 4 2,4-(OMe)2Ph NH 0 4-piperidino A 34 58 14 1r 4-Cl 4 3,4-(OMe)2Ph NH 0 4-piperidino A 54 74 15 1s 4-Cl 4 3-pyridine NH 0 4-piperidino B 46 89 16 1t 4-Cl 4 4-pyridine NH 0 4-piperidino B 27 54 17 1u 4-Cl 4 2-naphtalène NH 0 4-piperidino A 69 77 18 1v 4-Cl 4 2-benzothiophène NH 0 4-piperidino A 47 70 19 1w 4-Cl 4 2-indole NH 0 4-piperidino A 58* 39 20 1x 4-Cl 4 2-benzofurane NH 0 4-piperidino A 65 64 21 1y 4-Cl 4 2-furane NH 0 4-piperidino A 59 85 22 10a 4-Cl 4 Ph O 0 4-piperidino A 72 44 23 10b 4-Cl 4 Ph NMe 0 4-piperidino A 72 59 24 1d 4-Cl 4 iBu NH 0 4-piperidino C 75 40 25 1e 4-Cl 4 cPen NH 0 4-piperidino C 53 26 26 11a 4-Cl 4 Bn NH 0 4-piperidino C 34 56 27 11b 4-Cl 4 Phénéthyle NH 0 4-piperidino C 61 69 28 13a 4-Cl 4 Ph NH 1 4-piperidino A 72 86 29 13b 4-Cl 4 Ph NH 2 4-piperidino A 72 88 30 14c 4-Cl 4 Ph NH 0 A 72 73 31 1c 5-Br 5 Ph NH 0 4-piperidino A 83 79
Tableau 2. Méthodes de préparation de 2-aminopyrimidines diversement substitués en position 4
*Déprotection : TFA:DCM (1:1), ta, 2h, rendement sur 2 étapes.
En particulier, la réaction de Suzuki-Miyaura utilisant le Pd(OAc)2 en présence de KF71 et de l’acide boronique adéquat (Méthode A) a permis l’introduction régiosélective en position 4 des groupes aromatiques diversement substitués (Tableau 2, entrées 2 à 14, 17) ainsi que les cycles furane, benzofurane, benzothiophène et indole (entrées 18 à 21). Il est à noter que dans le cas du dérivé d’indole, la réaction est réalisée au départ de l’acide N-Boc-indole-2-boronique. Une déprotection dans un milieu équivolumique TFA/DCM permet d’isoler le produit de couplage déprotégé 17wa avec un rendement de 58% sur ces 2 étapes (entrée 19). Cependant, ces conditions de réactions ont été décevantes en présence des dérivés d’acides pyridineboroniques (dégradations des produits de départ). Nous avons de ce fait utilisé le complexe PdCl2dppf.DCM comme catalyseur, du Na2CO3
47
couplage attendus 17s-t avec cependant des rendements faibles non optimisés (respectivement 46% et 27% pour les dérivés 3- et 4-pyridines, entrées 15 et 16). Enfin, les restes isobutyle, cyclopentyle, benzyle et phénéthyle ont été introduits en mettant en jeu les dérivés magnésiens chlorés correspondants en présence d’un catalyseur au Fe(acac)3 (entrées 24 à 27).73 Pour ces dernières conditions, les rendements varient entre 34 et 75%.
Il est à noter que pour minimum un représentant de chaque famille, une RMN NOESY a été réalisée afin de confirmer la régiosélectivité des réactions de Suzuki-Miyaura ou de Grignard. Par exemple, dans le cas de la 2-chloro-4-phénylpyrimidine 17b, la RMN NOESY (Figure 30) met en avant des chorélations entre les protons H1-H2 et HA-HB+HC. Cette analyse met également en lumière la chorélation entre les protons HA-H2, confirmant la structure de notre composé.
Figure 30. Validation structurale du composé 2-chloro-4-phénylpyridimine 17b
La deuxième étape est une réaction de substitution nucléophile aromatique (SNAr) en présence d’un nucléophile (RNH2 ou ROH), de DIEA dans le DMSO à 100°C. Les dérivés aminés souhaités 1a-y, 10b,
11a-b, 13a-b, 14c ont été isolés avec des rendements compris entre 26 et 88%. Il est à noter qu’au
départ d’un alcool, par exemple la 1-benzyl-4-hydroxypipéridine, la réaction de SNAr nécessite la présence d’une base plus forte (NaH), afin de déprotoner l’alcool et ainsi former le produit désiré 10a avec un rendement de 44% (entrée 22).
Etant donné que les acides 4-cyclopentyloxyphénylboronique et 5-phénylfuran-2-ylboronique ne sont pas commerciaux, les dérivés 1k et 1z ont été préparés selon les voies de synthèses décrites respectivement dans le Schéma 2 et le Schéma 3.
48
a
4-OHPhB(OH)2 (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (5 mol%), KF (2.0 equiv.), MeOH, 120 °C, 20 mins, µM; bcyclopentanol (2.0 equiv.), DIAD (2.0 equiv.), PPh3 (2.0 equiv.), THF, 25 °C, 16h; c4-amino-1-benzylpiperidine (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100°C, 16h.
Schéma 2. Préparation du dérivé 2-amino-4-(4-cyclopentyloxyphényl)pyrimidine 1k
La préparation du dérivé O-cyclopentyle 1k (Schéma 2) a mis en jeu une réaction de Mitsunobu à l’aide de PPh3 et de DIAD au départ du phénol 17ka (obtenu comme décrit précédemment selon la Méthode A). Le produit attendu 17ka a été obtenu de manière quantitative. Enfin, la réaction de SNAr permet d’introduire la 4-amino-1-benzylpiperidine en position 2, pour aboutir au dérivé souhaité 1k avec un rendement de 47%.
a
NBS (1.1 equiv.), DMF, 25 °C, 7h; b4-amino-1-benzylpiperidine (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100°C, 16h; cPhB(OH)2 (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (10 mol%), S-Phos (20 mol%), CH3CN:H2O (1:1), 100 °C, 24h.
Schéma 3. Préparation du dérivé 2-amino-4-(5-phénylfuran-2-yl)pyrimidine 1z
L’introduction du 5-phénylfurane (composé 1z) se fait en 3 étapes au départ de la 2-chloro-(furan-2-yl)pyrimidine 17y (Schéma 3). Une première réaction de bromation à l’aide de NBS74 permet d’introduire régiosélectivement le brome en position 5 du groupement furane avec un rendement de 73%. Ensuite, une réaction de SNAr en position 2 de la pyrimidine décrite précédemment, suivie d’une réaction de Suzuki-Miyaura en présence du couple Pd(OAc)2/S-Phos (Méthode 1b, page 80) permet de former le produit souhaité 1z. Il est à noter que lors de la dernière étape, nous avons observé la formation de 8% de dérivé débromé 1y non séparable. Notre composé 1z a donc été utilisé dans les tests biologiques dans l’état (pureté : 92%).
Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés à faire varier le reste benzyle de la pipéridine. Pour ce faire, nous avons mis en place une méthode convergente comme illustré dans le Schéma 4. Cette méthode met en jeu le dérivé protégé N-Boc pipéridine. Après déprotection, une amination réductrice à l’aide d’aldéhydes commerciaux conduit aux dérivés attendus 12a-k, 14a-b,
d-f avec des rendements sur 2 étapes variant entre 26 et 54% après purid-fication par phase inverse. Ces
49 Rendements (%) Entrée Cpsé Het R 19 12, 14 1 12a 4-piperidino Me2 88 46 2 12b 4-piperidino cPen 88 56 3 12c 4-piperidino 2-OMePh 88 47 4 12d 4-piperidino 2-ClPh 88 41
5 12e 4-piperidino 3-OMePh 88 42
6 12f 4-piperidino 3-ClPh 88 42
7 12g 4-piperidino 4-OMePh 88 26
8 12h 4-piperidino 4-ClPh 88 30
9 12i 4-piperidino 3-pyridine 88 51
10 12j 4-piperidino 4-pyridine 88 31 11 12k 4-piperidino Bn 88 56 12 14d Ph 100 51 13 14e Ph 99 37 14 14a 3-piperidino Ph 71 39 15 14b Ph 88 61 16 14f Ph 86 64
Schéma 4. Synthèse des dérivés de 2-aminopyrimidines 12a-k et 14b-c, e-g : Méthode 2
a
nucléophile (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100°C, 16h; bTFA:DCM (1:1), 25 °C, 3h, 100%; cRCHO (2.0 equiv.), NaBH3CN (3.0 equiv.), MeOH, 25 °C, 48h.
4.1.2. Synthèse des dérivés de 2-aminopyrimidine trisubstituées 15a-f
Les composés 2-aminopyrimidines trisubstitués sont synthétisés au départ des dérivés 2,4-pyrimidinediones ou 2,4-dichloropyrimidines, selon les disponibilités commerciales, comme illustré dans le Schéma 5 et le Schéma 6.
L’introduction du substituant Et en position 5 met en jeu la pirymidine-dione 21c comme illustré dans le Schéma 5. L’activation par POCl3 conduit au dérivé 2,4-dichloropyrimidine 22c. Comme précédemment, la réaction de Suzuki-Miyaura (Méthode A) suivie d’une SNAr a permis d’isoler les composés 15a, c, e avec des rendements satisfaisants (Schéma 5). Dans le cas du composé 15f, après la réaction de SNAr, il reste une impureté inséparable par purification en phase normale et inverse. Afin d’isoler le produit 15f avec une bonne pureté (≥ 98%), la 4-amino-1-benzylpiperidine est
50 Rendements (%) Entrée Cpsé Position R 22 23 15 1 15a 5 Me / 66 68 2 15c 5 Et 51 45 72 3 15e 6 Me / 65 85 4 15f 6 CF3 / 69 39 a
pyridine (2.0 equiv.), POCl3 (35.0 equiv.), 110 °C, 2h; bPhB(OH)2 (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (5 mol%), KF (2.0 equiv.), MeOH, 120 °C, 20 mins, µM; c4-amino-1-benzylpiperidine (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100°C, 16h ; d 4-amino-1-benzylpiperidine (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (3 mol%), BINAP (6 mol%), Cs2CO3 (1.5 equiv.), dioxane, 105 °C, 15h.
Schéma 5. Synthèse des dérivés de 2-aminopyrimidines trisubtituées 15a-f
introduit via une réaction de Buchwald-Hartwig sur le dérivé de pyrimidine 23f en présence de Pd(OAc)2 et de BINAP.
Il a été récemment montré dans la littérature que l’encombrement stérique et l’effet électronique apporté par le groupement trifluorométhyle en position 5 permet d’inverser la réactivité des 2 iminochlorures.75 C’est pourquoi, nous avons inversé l’ordre des réactions de SNAr et de Suzuki-Miyaura de manière à obtenir préférentiellement l’isomère souhaité 24b avec un rendement de 60% contre 36% du régioisomère 24a non désiré mettant en jeu l’iminochlorure en 6 (Schéma 6). Pour ce cas précis, la réaction de SNAr a été réalisée en présence de DIEA dans le tBuOH75 à température ambiante. Enfin, la réaction de Suzuki-Miyaura a mis en jeu le couple Pd(OAc)2/S-Phos pour former le composé 15b souhaité avec un rendement non optimisé de 27%.
a
4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), DIEA (1.1 equiv.), tBuOH, 25 °C, 16h; bPhB(OH)2 (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (10 mol%), S-Phos (20 mol%), K2CO3 (4.0 equiv.), CH3CN:H2O (1:1), 100°C, 16h.
Schéma 6. Synthèse du dérivé de 2-amino-5-(trifluorométhyl)-6-phénylpyrimidine 15b
Enfin, l’introduction du OMe en position 4 (Schéma 7) utilise comme précurseur de choix la 2,6-dichloro-4-phénylpyrimidine obtenue par réaction de Suzuki-Miyaura au départ de la 2,4,6-trichloropyrimidine 22d à l’aide de Pd(OAc)2 et de PPh3 dans un mélange THF:H2O.76 Par la suite, 2 substitutions nucléophiles aromatiques consécutives utilisant le méthanolate de sodium77 et l’amino pipéridine N-benzylé conduisent au dérivé attendu 15d après purification sur colonne de gel de silice. Le rendement plutôt modeste de 49% pour la deuxième réaction peut être expliqué par la présence du groupement méthoxy donneur en position 6, qui rend l’iminochlorure encore moins électrophile.
51
a
PhB(OH)2 (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (2 mol%), PPh3 (4 mol%), Na2CO3 (2.0 equiv.), THF:H2O (1:2), 80 °C, 7h; bNaOMe (1.0 equiv.), MeOH, 80°C, 4h; c4-amino-1-benzylpiperidine (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 100°C, 16h.
Schéma 7. Synthèse du dérivé de 2-amino-4-méthoxy-6-phénylpyrimidine 15d
4.1.3. Synthèse du dérivé de 4-amino-2-phénylpyrimidine 25b
Le dérivé de 4-amino-2-phénylpyrimidine 25b est préparé en 2 étapes au départ de la 2,4-dichloropyrimidine, comme illustré dans le Schéma 8.
a
4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), DIEA (1.5 equiv.), iPrOH, 100°C, 16h; bPhB(OH)2 (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (10 mol%), S-Phos (20 mol%), K2CO3 (4.0 equiv.), CH3CN:H2O (1:1), 100 °C, 16h.
Schéma 8. Synthèse du dérivé de 4-amino-2-phénylpyrimidine 25b
Compte-tenu de la plus grande réactivité de l’iminochlorure en position 4, nous avons inversé l’ordre de réaction afin d’introduire l’amino pipéridine benzylé en position 4. Sous ces conditions, au départ de la 2,4-dichloropyrimidine 16a le régioisomère souhaité 25a a été obtenu avec un rendement de 60% contre 19% pour l’isostère 25b. Ces 2 régioisomères sont facilement séparables par purification sur colonne de silice. Ensuite, une réaction de Suzuki-Miyaura en présence du couple Pd(OAc)2 /S-Phos permet d’isoler le produit désiré 5 avec un rendement de 70%.
4.1.4. Synthèse du dérivé de 4-amino-6-phénylpyrimidine 9
Le dérivé de 4-amino-6-phénylpyrimidine 9 est préparé en 2 étapes au départ de la 4,6-dichloropyrimidine 26, comme illustré dans le Schéma 9.
a
4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), DIEA (1.5 equiv.), iPrOH, 100°C, 16h; bPhB(OH)2 (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (10 mol%), S-Phos (20 mol%), K2CO3 (4.0 equiv.), CH3CN:H2O (1:1), 100 °C, 16h.
Schéma 9. Synthèse du dérivé 4-amino-6-phénylpyrimidine 9
Le réactif de départ, la 4,6-dichloropyrimidine 26 présente un axe de symétrie. Ainsi, les 2 iminochlorures sont équivalents. La réaction de SNAr au départ de cet iminochlorure en présence de la 4-amino-1-benzylpiperidine et d’une base dans l’iPrOH permet d’introduire de manière
quasi-52
quantitative le dérivé aminé. Une réaction de Suzuki-Miyaura en présence de couple Pd(OAc)2 /S-Phos permet isoler la molécule souhaitée 9 avec un rendement de 76%.
4. 2. Synthèse des dérivés de pyridine et de pyrazine
4.2.1. Synthèse du dérivé de 2-amino-6-phénylpyridine et pyrazine 4 et 6
Les dérivés de 2-amino-6-phénylpyridine 4 et pyrazine 6 sont synthétisés en 2 étapes, comme illustré dans le Schéma 10.
a
4-amino-1-benzylpiperidine (2.0 equiv.), DIEA (2.0 equiv.), DMSO, 140°C, 48h; b4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), DIEA (1.5 equiv.), iPrOH, 120°C, 24h; cPhB(OH)2 (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (10 mol%), S-Phos (20 mol%), K2CO3 (4.0 equiv.), CH3CN:H2O (1:1), 100 °C, 16h.
Schéma 10. Synthèse des dérivés de 2-amino-6-phénylpyridine et pyrazine 4 et 6
Contrairement au cas précédent (4,6-dichloropyrimidine 26), la 2,6-dichloropyridine 28 nécessite un chauffage prolongé à 140°C pour l’introduction de la chaine amino pipéridine. L’aminopyridine 30 est alors engagée dans une réaction de Suzuki-Miyaura à l’aide du couple Pd(OAc)2/S-Phos et le composé 4 est obtenu avec un rendement de 85%. La même stratégie de synthèse a été appliquée au départ de la 2,6-dichloropyrazine 29 avec comme seule variante les conditions de la SNAr (DIEA, iPrOH, 120°C, 24h).
4.2.2. Synthèse du dérivé de 2-amino-4-phénylpyridine 3
Le dérivé de 2-amino-4-phénylpyridine 3 est synthétisé en 2 étapes au départ de la 4-bromo-2-chloropyridine, comme illustré dans le Schéma 11.
a
PhB(OH)2 (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (5 mol%), KF (2.0 equiv.), MeOH, 120 °C, 20 mins, µM; b4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (3 mol%), BINAP (6 mol%), Cs2CO3 (1.5 equiv.), dioxane, 105 °C, 16h.
Schéma 11. Synthèse du dérivé de 2-amino-4-phénylpyrimidine 3
Une réaction de Suzuki-Miyaura effectuée régiosélectivement sur l’atome de brome en présence de Pd(OAc)2 et KF71 au micro-onde a permis d’isoler l’intermédiaire clé 33 avec un rendement quasi-quantitatif. Contrairement à la chloro pyrimidine 17b, la chloropyridine est très peu réactive dans les conditions de SNAr. C’est pourquoi, nous avons introduit notre chaîne aminopipéridine à l’aide d’une réaction de Buchwald-Hartwig en présence de Pd(OAc)2 et de BINAP. Ces conditions de réaction ont permis d’isoler le produit souhaité 3 avec un rendement de 67% et peuvent se révéler intéressantes
53
pour introduire des chaînes aminées précieuses (non commerciales, utilisation d’un seul équivalent de nucléophile contre 2 pour la SNAr).
4. 3. Synthèse des dérivés de pyridazine
4.3.1. Synthèse du dérivé de 3-amino-5-phénylpyridazine 8a
Le dérivé de 3-amino-5-phénylpyridazine 8a est synthétisé en 5 étapes, comme illustré dans le Schéma 12.
a
N2H4.H2SO4 (1.2 equiv.), AcONa (1.2 equiv.), EtOH:H2O (1:1), 80 °C, 4h ; bHI (14.4 equiv.), H2O, 120 °C, 40h ; cPdB(OH)2 (1.1 equiv.), Pd(PPh3)4 (5 mol%), Na2CO3 (2.0 equiv.), DME:H2O (4:1), 140 °C, 15 mins, µW dPOCl3, 80°C, 2h ; e 4-amino-1-benzylpiperidine (1.0 equiv.), Pd(OAc)2 (3 mol%), BINAP (6 mol%), Cs2CO3 (1.5 equiv.), dioxane, 105 °C, 16h; f 4-amino-1-benzylpiperidine (1.2 equiv.), Pd(OAc)2 (5 mol%), JosiPhos (5 mol%), Cs2CO3 (1.5 equiv.), DMF, 90 °C, 16h ; *Rendement évalué par HPLC.
Schéma 12. Synthèse du dérivé de 3-amino-5-phénylpyridazine 8a
La 4,5-dichloropyridazinone 35 est obtenu par action d’hydrazine sur l’acide mucochlorique commercial 34 en présence d’AcONa avec un rendement de 80%.78 La mise en réaction de cet intermédiaire 35 avec du HI permet de réaliser en 1 étape un échange d’halogène en position 5 et une dehalogénation réductrice en position 4, avec un rendement de 72%.79–81 Puis, une réaction de Suzuki-Miyaura en présence de Pd(PPh3)4 réalisé aux microondes suivie d’une activation de la pyridazinone à l’aide de POCl3 permet de former l’intermédiaire clé 38. Contrairement au cas de la pipéridine, l’utilisation d’une amine primaire dans les mêmes conditions de réaction (Pd(OAc)2/BINAP) a conduit majoritairement au composé de diaddition 8b. Afin d’éviter cette diarylation, Jacques Bricard, au laboratoire, a montré l’efficacité du JosiPhos en présence de Pd(OAc)2
et de Cs2CO3. Sous ces conditions réactionnelles, le composé 8a a été obtenu avec un rendement de 33% après purification. Ce rendement médiocre, non optimisé, peut être expliqué par la faible solubilité du composé, qui a probablement cristallisé sur la colonne lors l’étape de purification en phase normale.
54
4.3.2. Synthèse du dérivé de 4-amino-6-phénylpyridazine
Le dérivé 4-amino-6-phénylpyridazine est synthétisé en 4 étapes au départ de la 4-bromopyridazine-dione 39 (Schéma 13).
a
NH2NH2.H2SO4 (1.0 equiv.), H2O, 100°C, 7h; bPOCl3 (20.0 equiv.), 110°C, 5h; c4-amino-1-benzylpiperidine (3.0 equiv.), iPrOH, 130°C, 16h; dHCOOH (1.0 equiv.), Pd(PPh3)4 (4 mol%), NEt3 (12.0 equiv.), DMF, 25-100°C, 10-45 mins, µW; ePhB(OH)2 (1.5 equiv.), Pd(OAc)2 (2 mol%), S-Phos (3 mol%), K2CO3 (2.5 equiv.), CH3CN:H2O (5:1), 115 °C, 16h.
Schéma 13. Synthèse du dérivé de 4-amino-6-phénylpyridazine
Le précurseur de choix pour la synthèse du dérivé amino-6-phénylpyridazine 7 est la 4-bromo-1,2-pyridazine-dione 40 obtenu au départ de l’anhydride maléique bromé 39 et d’hydrazine avec un rendement de 91%. Soumis à POCl3, cette pyridazine-dione conduit au dérivé trichloré 41 avec un rendement de 86%. Par la suite, une réaction de SNAr régiosélective sur l’atome de chlore en position 4 permet d’introduire le groupement aminé.78 Une réaction d’hydrogénolyse pallado-catalysée en présence d’acide formique a été réalisée, et a permis d’obtenir de manière régiosélective la 4-amino-6-chloropyridazine 43. Cette régiosélectivité peut être expliquée par l’assistance de l’azote en position 4 du cycle formant le palladacycle illustré dans la Figure 31 (travaux publiés par Emilie Blaise au laboratoire).78
Figure 31. Formation du palladacycle expliquant la réaction régiosélective en position 378
Enfin, l’utilisation du Pd(OAc)2 et de S-Phos a permis d’isoler le composé attendu 7 avec un rendement non optimisé de 12% pour les 2 étapes. Ce faible rendement peut être expliqué par la double purification du produit final (en phase normale et en phase inverse). Nous avons priviligié pour nos travaux la « qualité » du composé en récupérant uniquement les fractions ayant une pureté >98%.
5. Analyse RSA
Les différents composés synthétisés ont été testés in vitro pour leurs activités inhibitrices sur les cytokines pro-inflammatoires TNFα et IL1β. Une mesure de la viabilité cellulaire a été également effectuée. Ces tests ont été réalisés par la plate-forme PCBIS comme précisé précédemment. Nous donnons dans les tableaux les pourcentages d’inhibition et la viabilité cellulaire à 10 µM, et l’IC50
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5. 1. Etude du châssis moléculaire
Cette première évaluation vise à déterminer l’impact de la nature du châssis moléculaire sur l’activité de la molécule (Tableau 3). TNFα IL1β Entrée Cpsé V X Y Z %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 1b N N CH CH 34±16 13.4±2.6 5±4 29.4±2.5 110±17 2 4 N CH CH CH 13±5 nd 3±3 nd 100±10 3 3 CH N CH CH 36±17 12.2±0.8 10±24 >30 105±16 4 6 N CH N CH 15±4 nd -3±1 nd 99±2 5 5 N CH CH N -1 nd 7 nd 113 6 8a CH N N CH 3±9 nd 1±0 nd 90±2 7 7 CH CH N N -2 nd 0 nd 101 8 9 CH N CH N 17±3 nd 8±1 nd 99±3
Tableau 3. Influence de la nature du châssis moléculaire
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité nd = non déterminé
En prenant comme référence le RF 1431 (1b) qui présente une IC50 de 13.4±2.6 µM sur TNFα et 29.4±2.5 µM sur IL1β, nous obtenons des produits inactifs ou des produits d’activité inhibitrice équivalente mais aucun produit plus puissant. En particulier, la suppression de l’azote NX conduit à un composé inactif (4), mettant en avant la présence d’une interaction de type accepteur de liaison hydrogène de cet azote avec la cible. A l’opposé, la délétion de l’azote NV, conduit au dérivé de pyridine 3, ayant une activité similaire à notre molécule de référence. Ce résultat confirme la conclusion précédente et met également en lumière que l’azote NV n’est pas impliqué dans une interaction spécifique avec la cible.
Enfin, les autres châssis diazines (pyrimidines, pyridazines et pyrazine) conduisent tous à des composés moins actifs (6, 9) ou inactifs (5, 7, 8a). Il est intéressant de noter que mêmes les cycles diazines contenant NX, impliqué dans la liaison hydrogène avec la cible, sont concernés. La présence d’un deuxième accepteur de liaison hydrogène positionne probablement différemment le cation dans l’espace et de ce fait diminue l’activité des composés. Enfin, il est à noter que tous les composés décrits dans le Tableau 3 ne sont pas cytotoxiques (viabilité ≥ 90%).
5. 2. Importance du NH libre
56 TNFα IL1β Entrée Cpsé X %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 1b NH 34±16 13.4±2.6 5±4 29.4±2.5 110±17 2 10a O 6±2 nd 18±3 nd 101±2 3 10b NMe 4±2 nd 5±1 nd 111±2
Tableau 4. Importance du NH libre
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité nd = non déterminé
Le NH peut être impliqué dans une liaison de type donneur de liaison hydrogène avec la cible. C’est pourquoi, nous l’avons :
1) remplacé par un atome d’oxygène, accepteur de liaison hydrogène. 2) substitué par le plus petit groupement, le méthyle.
Les 2 composés obtenus sont inactifs, mettant en avant la présence d’une interaction importante du NH avec notre (ou nos) cible(s) biologique(s). Comme précédemment, ces composés ne sont pas cytotoxiques.
5. 3. Délétion, position et homologation du phényle
Cette troisième évaluation a pour but de déterminer l’importance du phényle et de sa position, mais également l’encombrement stérique toléré au voisinage de la position 4 de la pyrimidine (Tableau 5).
N N N H N R 4 5 TNFα IL1β Entrée Cpsé Position R %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 1a / H -4±1 nd 1±1 nd 93±2 2 1c 5 Ph -1 nd 8 nd 122 3 1b 4 Ph 34±16 13.4±2.6 5±4 29.4±2.5 110±17 4 1d 4 iBu 8±6 nd 5±1 nd 116±5 5 1e 4 cPen 42±3 5±0 nd 115±5 6 11a 4 Bn -3±9 nd -1±4 nd 103±2 7 11b 4 Phénéthyl 2±3 nd 9±0 nd 100±2
Tableau 5. Importance du phényle et de sa position et effet d’homologie
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité nd = non déterminé
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Un groupement phényle peut être impliqué soit dans une interaction hydrophobe, soit dans une interaction π-π avec notre cible biologique. Afin de déterminer si notre groupement 4-phényle interagit avec la cible, nous l’avons dans un premier temps supprimé. Le dérivé 1a obtenu est inactif, ce qui met en lumière l’importance de la présence de cet aromatique. Dans le but de déterminer la nature de cette interaction, le groupement phényle a été remplacé respectivement par un iBu (1d) et un cPen (1e). Le 1d est inactif, alors que le dérivé 1e a une inhibition comparable à notre molécule de référence à 10 µM. Etant donné que les groupements phényle et cyclopentyle ont un caractère lipophile et géométrique équivalents, ce résultat met en lumière l’interaction hydrophobe avec la cible biologique. Afin de trouver la position optimale pour cette interaction lipophile, nous avons déplacé le phényle en position 5. Dans ce cas, le dérivé 1c obtenu est inactif ce qui met en lumière l’importance de la position du phényle en 4 pour réaliser l’interaction optimale.
Enfin, nous avons évalué l’encombrement stérique toléré au niveau de la position 4 de la pyrimidine. Pour ce faire, nous avons éloigné la plateforme aryle à l’aide de 2 espaceurs flexibles : benzyle (composé 11a) et phénéthyle (composé 11b). Cependant, la présence d’un espaceur entre la pyrimidine et l’aromatique donne des composés inactifs. Ceci traduit peut-être une proximité de la protéine dans cette zone qui serait sensible à l’encombrement stérique.
5. 4. Substitution du phényle
Cette quatrième étude avait pour but de déterminer l’influence de la substitution du phényle (Tableau 6).
Etant donné qu’un phényle peut aussi n’être qu’un bon répartiteur d’interaction, nous avons utilisé ce cycle pour étudier l’effet de substitution du groupe lipophile. La position ortho de l’aromatique tolère des groupements électrodonneur (OMe, 1f, entrée 2) ou électroattracteur (Cl, 1g, entrée 3) sans affecter l’activité anti-TNFα de nos molécules. L’introduction en méta d’un groupement électroattracteur conduit a un produit inactif (Cl, 1i, entrée 5). Par contre, lorsque l’on remplace l’atome de chlore par un électrodonneur (OMe, 1h, entrée 4), on obtient un composé présentant une activité inhibitrice équivalente au RF 1431 (1b) (1h, IC50 = 9.9±0.5 µM).
Enfin, l’introduction d’un groupement méthoxy en para conduit à un composé plus puissant (1j, IC50 = 4.4±0.3 µM, entrée 6), et plus sélectif pour IL1β (IC50 = 17.6±0.7 µM). Ce résultat met en lumière l’existence possible d’une liaison hydrogène du groupe méthoxy avec la cible. Afin d’évaluer l’encombrement toléré au niveau de cette interaction, le méthyle a été remplacé par un cyclopentyle, plus encombrant. Cette substitution conduit au 1k (entrée 7), qui a une activité similaire à notre molécule de référence (RF 1431, 1b). Nous pouvons donc en conclure qu’un encombrement stérique est toléré en position para du groupement phényle, mais que la présence du groupement lipophile cPen sur l’oxygène pourrait gêner la formation de la liaison hydrogène avec la