pathiques chez la
8. Analyse RSA autour du RF 0522 (46a)
Les composés étudiés dans le cadre de cette RSA (Figure 59) ont été préparés selon des stratégies identiques à leur homologue de position, le RF 0913 (2a, Chapitre 2.3 Synthèse des dérivés du RF 0913 (2a) et du RF 0522 (46a, page 78). Ces composés ont été étudiés pour leur capacité à inhiber la protéine kinase MSK1 à 2 concentrations (10 et 1 µM). Ces études ont été réalisées par la plateforme PCBIS.
109
Figure 59. Etude topologique autour de RF 0522 (46a)
8. 1. Présentation du test
Le test enzymatique pour mesurer l’activité inhibitrice de MSK1 est réalisé à l’aide du kit Kinase-Glo® Luminescent Kinase Assay de Promega. Pour ce faire, un mélange contenant la kinase MSK1 et son substrat est incubé pendant 4 heures à température ambiante en présence du composé à étudier. Durant ce temps d’incubation, la kinase va phosphoryler le substrat. Cette réaction enzymatique est ensuite arrêtée par ajout d’une luciférine, qui en présence de Mg2+ et d’ATP catalyse son substrat en oxyluciférine avec émission d’un photon (Figure 60). La réaction est quantifiée par mesure du signal luminescent sur le lecteur de plaque « Victor Light ». Ce signal est proportionnel à la quantité d’ATP présent dans le milieu réactionnel et donc inversemment proportionnel à l’activité enzymatique (Figure 61).
Figure 60. Test enzymatique de l'activité de MSK1 en l’absence d’inhibiteur
Figure 61. Test enzymatique de l'activité de MSK1 en présence d'un inhibiteur
substrate
110
8. 2. Etude de la position et de l’homologation du phényle
Cette première étude vise à évaluer l’importance de la position du groupement phényle sur le châssis pyridine et l’effet d’homologation (Tableau 18).
Entrée Cpsé R %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%) 1 44 3-Ph 12±1 1±1 nd 2 2a 4-Ph 5±1 -4±1 nd 3 45a 5-Ph -11±1 -10±2 nd 4 RF 0522 (46a) 6-Ph 42±9 4±4 17.9±3.9 5 46s 6-Bn -7±2 10±1 nd 6 46t 6-(CH2)2Ph -8±1 -4±1 nd 7 45h 5-(CH2)2Ph 4±2 4±3 nd
Tableau 18. Influence de la position du phényle sur le châssis pyridine et de l'effet d'homologie
nd = non déterminé
Notre composé de référence, le RF 0522 (46a), montre une modeste inhibition sur MSK1 (IC50 = 17.9±3.9 µM). La position du phényle est importante pour l’activité, car le déplacement de ce groupement vers les positions 3 (44), 4 (RF 0913, 2a) et 5 (45a) conduit à des composés inactifs. Dans le but d’évaluer l’encombrement stérique toléré en position 6, nous avons introduit en cette position deux espaceurs flexibles: un benzyle (46s) et un phénéthyle (46t). Cependant, ces deux produits se sont montrés inactifs sur cette kinase. Un résultat identique a été obtenu lorsqu’on introduit un groupement phénéthyle en position 5 (45h).
8. 3. Substitution du phényle en position 6
Dans un deuxième temps, l’effet des substitutions du phényle a été réalisé en position 6 afin d’identifier les meilleurs substituants du cycle aromatique (Tableau 19).
Un bel effet a été observé lors d’une substitution en position ortho du phényle à la fois avec des groupements electrodonneurs (Me, 46d ; OMe, 46f) et électroattracteurs (F, 46b ; CF3, 46c ; Cl, 46e). Ce gain d’activité peut donc être expliqué par un effet géométrique du substituant en ortho imposant une rotation hors du plan de la molécule. Cet effet est cependant optimal avec l’atome de chlore (46e, IC50 = 0.7±0.4 µM), car il permet de gagner 1 log d’activité par rapport à notre molécule de référence. Le déplacement du chlore en position méta (46j) conduit à un composé 2 fois plus actif que notre hit de départ (IC50 = 9.7±1.0 µM). A l’opposé, l’introduction d’un groupement méthoxy en position méta (46k) et d’un groupement électrodonneur (OMe, 46m) ou électroattracteur (Cl, 46l ; CF3, 46n) en positions para conduit à des dérivés moins actifs ou totalement inactifs.
Nous avons par la suite réalisé une disubstitution du groupement phényle afin de rechercher un effet synergique. Pour ce faire, nous avons synthétisé les composés 2,3-Cl2 (46g), 2,4-Cl2 (46h) et 2,5-Cl2
(46i). Ces produits disubstitués en positions ortho et meta (46g et 46i) ont une activité sur la kinase MSK1 équivalente au composé monochloré (46e), mettant en avant une tolérance stérique. A
111
l’opposé, le composé disubstitué en positions ortho et para (46h) conduit à un composé moins actif (%inhib de 30±8% à 10 µM).
Entrée Cpsé R %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%) 1 RF 0522 (46a) H 42±9 4±4 17.9±3.9 2 46b 2-F 45±12 9±7 5.0±0.5 3 46c 2-CF3 35±14 0±3 8.1±1.2 4 46d 2-Me 34±13 -9±7 3.5±0.3 5 46e 2-Cl 60±9 92±13 0.7±0.4 6 46f 2-OMe 70±16 15±2 2.3±0.3 7 46j 3-Cl 43±5 -2±3 9.7±1.0 8 46k 3-OMe 3±5 -17±3 ns 9 46l 4-Cl 23±1 -4±5 ns 10 46m 4-OMe -3±4 -12±1 ns 11 46n 4-CF3 -8±3 -9±4 ns 12 46g 2,3-Cl2 81±16 1±7 2.1±0.2 13 46h 2,4-Cl2 30±8 -3±1 ns 14 46i 2,5-Cl2 97±11 20±13 0.9±0.1
Tableau 19. Substitution du phényle en position 6
ns = non significatif
Nous avons obtenu des composés moins actifs (46p) ou totalement inactifs (46o et 46q), lorsque le phényle est remplacé par un hétérocycle comme une pyridine (46o), un furane (46p) ou un benzofurane (46q) (Figure 62). Enfin, nous avons montré que le groupement aromatique est impliqué
Figure 62. Remplacement du phényle par des hétérocycles
Position 2
Position 3
Position 4
112
dans une interaction de type π-π avec la cible biologique. En effet, son remplacement par un groupement pipéridine (46r), ayant un lipophilie comparable à un phényle, conduit à un composé inactif.
8. 4. Analyse de l’isostérie (guanidine -> thiourée)
Cette troisième étude a pour but d’évaluer l’impact de la basicité du composé sur l’activité inhibitrice de MSK1 (Tableau 20).
Entrée Cpsé X %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%)
1 RF 0522 (46a) NH 42±9 4±4 17.9±3.9
2 46u S -5±3 2±10 ns
Tableau 20. Influence de la basicité de la guanidine
ns = non significatif
Le remplacement de la fonction basique guanidine par une fonction neutre thiourée conduit à un dérivé inactif (46u). Ce résultat montre l’importance de la guanidine dans l’activité inhibitrice de MSK1. Ceci peut être expliqué par les interactions multiples de la guanidine (interactions de type électrostatiques ou accepteur/donneur de liaisons hydrogènes) au sein du site de fixation mais également par les spécificités structurales amenées par la liaison hydrogène intramoléculaire présentée précédemment.
8. 5. Rigidification de la liaison hydrogène intramoléculaire
Comme dans le cas de l’étude précédente (Chapitre 2.4 Analyse RSA autour du RF 0913), nous avons rigidifié la liaison hydrogène intramoléculaire pour former 3 châssis bicycliques (Figure 63) : benzimidazoles (47b), dihydroquinazolines (48b) et dihydrobenzodiazépine (49a).
L’activité inhibitrice de MSK1 varie avec la taille du cycle. Le 2-amino-4-phénylbenzimidazole 47b (n = 0) est le produit le plus actif de la série avec une IC50 de 3.6±0.5 µM. Le passage au dérivé de 2-aminodihydroquinazoline 48b (n = 1) présente une activité équivalente au dérivé de pyridine 46a (RF 0522). Enfin, la préparation du dérivé de 2-aminodihydrobenzodiazépine 49a (n = 2) a conduit à un dérivé totalement inactif. Par la suite, nous nous sommes intéressés aux effets de substitution de l’aromatique dans les séries benzimidazoles (47) et dihydroquinazolines (48) et à la substitution de la fonction guanidine dans la série dihydroquinazoline.
113
Figure 63. Rigidification de la liaison hydrogène intramoléculaire du RF 0522 (46a)
8.5.1. Dérivés de benzimidazoles
L’effet de substituton du phényle en série 2-aminobenzimidazole a été évalué. Les différents dérivés préparés sont représentés dans le Tableau 21.
Entrée Cpsé R %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%) 1 47a H -17±3 -23±8 ns 2 47b 4-Ph 47±9 -1±5 7.8±1.2 3 47c 4-(2-ClPh) 64±8 11±8 2.0±0.3 4 47d 4-(2,3-Cl2Ph) 73±6 19±3 5.8±1.4 5 47e 4-(2,5-Cl2Ph) 49±6 2±8 12.0±1.7 6 47f 4-(2-OMePh) 28±7 -11±6 ns 7 47g 4-(4-ClPh) 36±3 -11±3 ns 8 47h 4-(4-OMePh) 16±5 -14±10 ns 9 47i 5-Ph -8±7 -17±8 ns
Tableau 21. Rigidification de la liaison hydrogène intramoléculaire en benzimidazoles
ns = non significatif
Contrairement au monocycle correspondant (dérivé de pyridine 46a), l’effet de substitution est moins intéressant. En effet, la présence d’un chlore en ortho n’augmente pas de manière significative l’activité inhibitrice pour MSK1 (comparer 47c, entrée 3 avec 46a, Tableau 19, entrée 1). L’introduction d’un méthoxy en ortho conduit à un produit inactif (47f, entrée 6). Cette inactivité est retrouvée lorsque l’on substitue la position para par un groupement électroattracteur (47g, entrée 7)
114
ou électrodonneur (47h, entrée 8). Ensuite, les composés dichlorés substitués en positions ortho et méta (47d et 47e) conduisent à des composés ayant des IC50 respectives de 5.8±1.4 et 12.0±1.7 µM. Enfin, les dérivés non substitué (47a) et substitué avec le phényle en position 5 (47i) conduisent à des composés inactifs.
8.5.2. Dérivés de dihydroquinazolines
8.5.2.1. Substitution des composés 2-aminodihydroquinazolines
L’effet de substitution du phényle en série 2-aminodihydroquinazoline a été évalué. Les différents dérivés préparés sont représentés dans le Tableau 22.
Entrée Cpsé R %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%) 1 48a H -7±2 -7±3 nd 2 48b 5-Ph 44 nd 15.8±3.2 3 48c 5-(2-ClPh) 15±7 2±7 16.4±4.0 4 48d 5-(2-OMePh) -6±1 -19±5 ns 5 48e 5-(3-ClPh) -1±7 -18±6 ns 6 48f 5-(3-OMePh) -10±6 -20±3 ns 7 48g 5-(4-ClPh) -12±3 -18±5 ns 8 48h 5-(4-OMePh) -19±4 -19±2 ns 9 48i 6-Ph 9±3 8±8 ns 10 48k 7-Ph -13±3 -1±4 ns
Tableau 22. Rigidification de la liaison hydrogène intramoléculaire en dihydroquinazolines
ns = non significatif
Comme illustré dans le Tableau 22, dans la série des dihydroquinazolines, l’effet ortho chloré n’est pas retrouvé pour 48c (entrée 3) qui présente une activité inhibitrice équivalente au dérivé non substitué 48b (entrée 2). Toutes les autres substitutions ont conduient à des dérivés inactifs.
8.5.2.2. Substitution de l’azote exocyclique
Enfin, nous avons voulu évaluer la possibilité de substituer l’azote exocyclique. Nous avons pour ce faire introduit un reste propyle (88a) et un reste phényle (88b) de manière à évaluer l’encombrement toléré au voisinage de l’amine exocyclique (Tableau 23). Cependant, ces 2 dérivés se sont révélés inactifs.
115
a
CSCl2 (1.4 equiv.), NEt3 4.0 equiv.), Et2O, -78°C à ta, 10h ; bMeI (3.0 equiv.), acétone, ta, 12h ; (c) pour R = nPr : propylamine, 110°C, 30min, µW ; (d) pour R = Ph : aniline, 160°C, 3h.
Schéma 33. Formation des dérivés de dihydroquinazolines substitués sur l'azote exocyclique
Entrée Cpsé R %inhib sur MSK1 à IC50 (µM)
10 µM (%) 1 µM (%)
1 48b H 44 nd 15.8±3.2
2 88a n-Pr -7±5 -9±1 ns
3 88b Ph -7±1 -12±3 ns
Tableau 23. Effet de substitution de l'azote exocyclique
ns = non significatif
Ces composés ont été préparés comme illustré dans le Schéma 33. Au départ de la 2-amino-6-phénylbenzylamine 64b, une réaction de cyclisation à l’aide de thiophosgène conduit à la thiourée cyclique 89. Par action d’iodure de méthyle, l’isothiourée 90 à été isolée avec un rendement de 90%. Enfin, une réaction de SNAr avec l’amine adéquate permet d’isoler les produits souhaités 88. Les faibles rendements résultent de la purification en phase inverse pour laquelle on sélectionne les fractions les plus pures (>95%). Ces rendements de récupérations de produit n’ont pas été optimisés.