Traitement des douleurs neuropathiques chez la souris : résultats in
Chapitre 2. Développement de dérivés de pyridin-2-yl guanidines (RF 0913 et RF 0522) comme inhibiteurs de TNFα
4. Analyse RSA autour du RF 0913 (2a)
Les différents composés synthétisés ont été testés in vitro pour leur activité inhibitrice sur les cytokines pro-inflammatoires TNFα et IL1β. Une mesure de la viabilité cellulaire a été également réalisée. Comme précédement, ces tests ont été réalisés par la plateforme PCBIS (UMS 3286). On donne dans les tableaux les pourcentages d’inihibition à 10µM pour le TNFα et IL1β, ainsi que la viabilité cellulaire. Pour les molécules les plus actives, les valeurs d’IC50 seront également reportées.
4. 1. Etude de la position du phényle
Cette première évaluation vise à déterminer l’impact de la position du phényle sur l’activité de la molécule (Tableau 13).
91 TNFα IL1β Entrée Cpsé R %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 44 3-Ph 11 ns 1 ns 108 2 2a 4-Ph 67 1.2±0.1 91 5.8±0.4 72 3 45a 5-Ph -9 ns -1 ns 97 4 46a 6-Ph 18 18.6±0.9 3 >30 100
Tableau 13. Influence de la position du phényle sur le châssis pyridine
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité ns = non significatif
Notre composé de référence, le RF 0913 (2a) présente un pourcentage d’inhibition sur le TNFα de 67% avec une IC50 de 1.19±0.03 µM et une viabilité de 67%. Cependant, ce composé n’est pas sélectif vis-à-vis d’IL1β et présente pour cette cytokine une IC50 de 5.79±0.38 µM. Enfin, la position du phényle semble critique du fait que le déplacement du phényle en positions 3, 5 et 6 conduit à des produits inactifs.
4. 2. Influence de la nature de la substitution du phényle
Dans un deuxième temps, nous avons voulu évaluer la possibilité de substitution des pyridines guanidines sur le phényle en position 4 mais aussi en positions 5 etu 6 (Tableau 14). Cette exploration aromatique devrait permettre de préciser les substitutions optimales sur cette partie aromatique de la molécule.
4.2.1. Substitution du phényle en 4
On peut tout d’abord constater une perte totale de l’activité inhibitrice TNFα mais aussi IL1β, lorsque l’on introduit un groupement accepteur de liaison hydrogène (OMe) en position ortho du phényle (entrée 3). Cependant, lorsque le reste méthoxylé est déplacé en position méta ou para (entrées 5 et 7), on restaure l’activité inhibitrice de ces composés avec un pourcentage d’inhibition à 10 µM pour TNFα du même ordre de grandeur que notre hit de référence (RF 0913, 2a). De plus, la présence en position méta du méthoxy inverse la sélectivité pour IL1β avec un pourcentage d’inhibition de 29% contre 91% pour notre hit (comparer les entrées 1 et 5). Enfin, ce composé 2e présente une viabilité cellulaire de 66%, toujours comparable à notre molécule de référence contre 34% pour son régioisomère 2g (entrée 7). La substitution du phényle par un chlore est tolérée quelque soit sa position sur l’aromatique (entrées 2, 4 ou 6), avec une activité inhibitrice similaire sur TNFα comparée au hit de référence. Par contre, le profil de sélectivité par rapport à IL1β varie. En particulier, lorsque le chlore est introduit en ortho du phényle, le pourcentage d’inhibition sur IL1β diminue à 23% contre 91% pour le RF 0913 (2a). Cependant, il est important de noter que pour ces 3 dérivés, la viabilité cellulaire chute de manière drastique, mettant en avant un effet cytotoxique des molécules. Le remplacement du chlore en position para par un CF3 donne des résultats similaires
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(comparer les entrées 6 et 8). Les inhibitions mesurées sur les cytokines pro-inflammatoires seraient donc biaisées par la mort des cellules, ne produisant plus de TNFα et d’IL1β.
TNFα IL1β
Entrée Cpsé Position R %inhib à
10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 2a 4 H 67 1.2±0.1 91 5.8±0.4 72 2 2b 4 2-Cl 65 nd 23 ns 42 3 2c 4 2-OMe 10 ns -1 ns 99 4 2d 4 3-Cl 64 nd 53 nd 38 5 2e 4 3-OMe 56 nd 29 ns 66 6 2f 4 4-Cl 69 nd 97 nd 24 7 2g 4 4-OMe 69 nd 86 nd 34 8 2h 4 4-CF3 71 nd 98 nd 24 9 45a 5 H -9 ns -1 ns 97 10 45b 5 2-Cl 82 nd 96 nd 55 11 45c 5 2-OMe 56 7.7±0.9 4 ns 78 12 45d 5 3-Cl 52 5.5±0.5 8 ns 94 13 45e 5 3-OMe 25 nd 4 ns 116 14 45f 5 4-Cl 72 nd 97 nd 23 15 45g 5 4-OMe 58 nd 48 nd 34 16 46a 6 H 18 18.6±0.9 3 ns 100 17 46e 6 2-Cl 47 19.2±1.9 9 ns 74 18 46f 6 2-OMe 7 ns 1 ns 106 19 46j 6 3-Cl 74 nd 80 nd 40 20 46k 6 3-OMe 7 ns 2 ns 104 21 46l 6 4-Cl 72 nd 77 nd 35 22 46m 6 4-OMe 27 nd -6 ns 94
Tableau 14. Influence de la substitution du phényle en positions 4, 5 et 6
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité nd = non déterminé, ns = non significatif
4.2.2. Substitution du phényle en position 5
Comme mentionné dans le paragraphe 4. 1, le déplacement du phényle de la position 4 à la position 5 conduit à un composé inactif (comparer les entrées 1 et 9). Cependant, l’introduction des substituants adéquats peut restaurer l’activité inhibitrice. En particulier, l’introduction d’un atome de chlore en ortho (45b, entrée 10) ou para (45f, entrée 14) conduit à des composés d’activités inhibitrices similaires (45f) voir supérieur (45b) pour TNFα et Il1β mais avec une cytotoxicité plus importante (55 et 23% respectivement). Lorsque le substituant chlore est en position méta (45d, entrée 12), on obtient un composé d’activité 5 fois moindre sur TNFα avec cependant un début de sélectivité pour IL1β (8% à 10µM) et une bonne viabilité cellulaire (94%).
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Cette étude a également montré la possibilité de substitution du phényle en 5 par un reste méthoxy en ortho (45c, entrée 11). En effet, cette substitution permet d’inhiber le TNFα à 56% à 10µM avec une sélectivité pour IL1β (4% à 10µM) et une viabilité cellulaire de 78%. Enfin, le déplacement du méthoxy en méta (45e, entrée 13) ou para (45g, entrée 15) conduit respectivement à un composé totalement inactif ou cytotoxique.
4.2.3. Substitution du phényle en 6
Comme précédemment, le déplacement du phényle de la position 4 à la position 6 conduit au RF 0522 (46a) qui est 10 fois moins actif que notre hit départ (RF 0913, 2a). Aucun bénéfice n’a été observé lorsque l’on introduit un chlore en position ortho (46e, entrée 17). Enfin, le déplacement du chlore en positions méta (46j, entrée 19) et para (46l, entrée 21) permet d’avoir une inhibition des cytokines TNFα et IL1β comparable à notre molécule de référence RF 0913 (2a). Cependant, dans les 2 cas, la viabilité cellulaire chute drastiquement à 40 et 35% respectivement. Enfin, l’introduction d’un groupement électro-donneur (OMe) dans les positions 2 (46f, entrée 18), 3 (46k, entrée 20) et 4 (46m, entrée 22) conduit à des composés inactifs.
Le composé de référence RF 0913 (2a) est puissant mais présente une cytotoxicité qui pourrait expliquer les effets anti-cytokines observés expérimentalement. On remarque aussi que tous les dérivés substitués plus puissants sont aussi plus cytotoxiques, à l’exception des dérivés 5-aryles 45c (R=2-OMe) et 45d (3-Cl).
4. 3. Dérivé de la thiourée
La troisième évaluation vise à préciser l’importance de la guanidine sur l’activité pro-inflammatoire (Tableau 15). TNFα IL1β Entrée Cpsé X %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 2a NH 67 1.2±0.1 91 5.8±0.4 72 2 2i S 4 ns -1 ns 86
Tableau 15. Influence de la basicité du composé
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité ns = non significatif
Le remplacement de la fonction basique guanidine par une fonction neutre thiourée conduit à un dérivé inactif. Ce résultat montre l’importance de la guanidine dans l’activité anti-inflammatoire. Ceci peut être expliqué par les interactions multiples de la guanidine (interactions de type électrostatique combinées avec un système accepteur/donneur de liaisons hydrogènes) au sein du site de fixation
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mais également par les spécificités structurales amenées par la liaison hydrogène intramoléculaire présentée précédemment.
4. 4. Analogues cycliques du RF 0913 (dihydroquinazolines et homologues)
La conception et la synthèse des analogues rigidifiés pourraient apporter des informations supplémentaires sur la conformation active des composés. Ainsi, une manière de rigidifier serait d’introduire la guanidine dans un hétérocycle de 5, 6 ou 7 maillons. De plus, cette rigidification peut mimer la possibilité de liaison hydrogène intramoléculaire entre l’azote de la pyridine et un des NH de la guanidine99 (Figure 45, page 78).
Les résultats in vitro pour les différents bicycles synthétisés sont présentés dans le Tableau 16.
TNFα IL1β Entrée Cpsé n R %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) %inhib à 10µM (%) IC50 (µM) Viabilité (%) 1 47i 0 5-Ph 15 ns 3 ns 114 2 48b 1 5-Ph 7 ns 0 ns 111 3 48i 1 6-Ph 22 nd nd 90 4 48j 1 6-(2-OMe)Ph 13 ns 1 ns 126 5 48k 1 7-Ph 76 1.0±0.1 93 3.7±0.2 81 6 49b 2 8-Ph -7 ns -4 ns 100
Tableau 16. Mimétisme de la liaison hydrogène intramoléculaire potentielle : accès aux systèmes bicycliques 47-49
Viabilité ≥ 80% 80% ≥ Viabilité > 60% 60% > Viabilité nd = non déterminé, ns = non significatif
Parmi tous les composés synthétisés, la 2-amino-dihydroquinazoline 48k, portant un phényle en position 7 est le seul produit actif avec une IC50 de 1.0±0.1 µM pour TNFα et 3.7±0.2 pour IL1β et une viabilité cellulaire de 81% (48k, entrée 5). Ce composé est comparable à notre hit de référence. Ce
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résultat valide l’hypothèse de la liaison hydrogène intramoléculaire dans la conformation active du hit de départ. Le déplacement du phényle de la position 7 à la position 6 conduit à un produit inactif (48i, entrée 3). Ce dérivé peut être comparé au résultat obtenu avec le composé 45a (Tableau 13, entrée 9). Cependant, de manière surprenante, l’effet bénéfique du 2-méthoxy observé pour le composé 45c (Tableau 13, entrée 11) n’est pas retrouvé dans la série cyclique. En effet, le composé
48j (Tableau 16, entrée 4) est inactif. Le déplacement du phényle en position 5 conduit également à
un composé totalement inactif (48b, entrée 2), alors que l’analogue ouvert (pyridine guanidine) 46a avait une activité modeste avec une IC50 de 18.6±0.9 µM sur le TNFα (Tableau 13).
Enfin l’homologue inférieur (n = 0, 47i, entrée 1), mais aussi l’homologue supérieur (n = 2, 49b, entrée 6) sont tous les deux inactifs. L’hypothèse pouvant être avancée pour expliquer l’inactivité de ces 2 composés est la position du phényle qui n’est probablement pas placé de manière optimale dans la poche de la cible et de ce fait ne peut pas établir les interactions spécifiques avec la cible biologique.
4. 5. Conclusion de l’analyse RSA autour du RF 0913 (2a)
Cette étude RSA a mis en lumière l’importance de la position du phényle en position 4 de la pyridine (RF 0913, 2a) comme inhibiteur de la surproduction de TNFα. Des effets bénéfiques de la substitution aromatique ont été observés avec l’introduction d’un chlore, méthoxy ou CF3, mais les produits qui en résultent se sont révélés cytotoxiques. C’est pourquoi l’étude topologique a été arrêtée à ce stade. Il est cependant intéressant de noter qu’il est possible de rigidifier la liaison hydrogène intramoléculaire du RF 0913 (2a) pour former un châssis bicyclique plus innovant : la dihydroquinazoline, sans modifier le profil d’activité sur les cytokines pro-inflammatoires.
Enfin, les 2 meilleures molécules (RF 0913 (2a) et 48k), mises en lumière lors de l’étude topologique, ont été testées sur des modèles in vivo (Chapitre 2.6 Traitements de l’inflammation et des douleurs neuropathiques chez la souris : résultats in vivo). Ces 2 hits (RF 0913 (2a) et 48k) ont été testés chez notre collaboratrice, Dr. Nelly Frossard (UMR 7200, Pharmacologie de l’inflammation), sur un modèle d’inflammation allergique des voies aériennes. Son homologue cyclique, 48k, a quant à lui également été tésté sur le modèle de douleur neuropathique chez notre partenaire, le Dr. Michel Barrot. C’est pourquoi, au préalable, nous avons été amenés à mesurer la solubilité en milieu salin (NaCl 1/1000) des ces 2 composés en utilisant la méthode décrite précédemment (Chapitre 1.6 Solubilité aqueuse, page 63).