Les nouveaux instruments en spectrométrie de masse à haute résolution

Comme expliqué précédemment, un spectromètre de masse est composé d’une source d’ionisation et d’un analyseur couplé à un détecteur. Différents types de sources d’ionisation peuvent être utilisés en métabolomique comme l’ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI, Atmospheric-Pressure Chemical Ionisation), la photoionisation à pression atmosphérique (APPI, Atmospheric-Pressure PhotoIonisation) ou l’ionisation par électrospray (ESI, Électrospray Ionisation). Cette dernière est la plus utilisée pour les analyses métabolomiques par LC-MS avec 90% des publications mentionnant l’utilisation de cette source contre 6 % pour l’APCI et 2% pour l’APPI (Forcisi

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et al., 2013). Ces différentes sources ne sont pas détaillées dans le corps de ce manuscrit mais sont présentées en Annexe 1.

La partie analyseur et détecteur constitue le cœur du spectromètre de masse. Une fois formés au niveau de la source, les ions sont conduits jusqu’à l’analyseur via des optiques de transfert. Ils vont être analysés afin de déterminer leur rapport masse sur charge. En métabolomique non ciblée, l’intégralité du métabolome étant encore loin d’être connue, il est nécessaire de pouvoir identifier sans a priori les molécules détectées. Pour ce faire, l’utilisation d’analyseur à haute résolution est essentielle afin d’obtenir les informations les plus précises possibles. La haute résolution permet d’abord de séparer les nombreux composés isobares (composés ayant la même masse nominale mais des masses exactes différentes) présents dans les fluides biologiques complexes. Cela donne un signal spécifique pour chaque ion et non plus un signal regroupant plusieurs ions isobares. Grace à cela, la précision de mesure de masse d’un ion isolé est grandement augmentée (de l’ordre du ppm), ce qui permet d’avoir accès à la formule brute des ions détectés.

Il existe différents types de spectromètres de masse à haute résolution. Les principaux sont les spectromètres de masse à Temps de Vol (TOF, Time Of Flight), les spectromètres à Résonance Cyclonique Ionique (FT-ICR, Fourrier Transform – Ion Cyclotron Resonance) et les spectromètres de masse de technologie Orbitrap. Différents éléments permettent d’évaluer les performances de ces analyseurs : la résolution, la précision de mesure de masse et la vitesse d’acquisition.

La résolution correspond à la capacité de l’analyseur à séparer, sur le spectre de masse, deux ions présentant des masses proches. Cette résolution est donc en lien directe avec la largeur des pics de masse enregistrés. Elle est définie comme :

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où m correspond au rapport masse sur charge mesuré et Δm à la largeur du pic

Afin d’uniformiser les définitions de la résolution, cette dernière est en générale calculée en prenant la largeur du pic à la moitié de sa hauteur. Cette résolution sera appelée FWMH (Full Width Mid High). Il est aussi important de faire la différence entre la résolution et le pouvoir résolutif (PR) d’un analyseur. La résolution peut être mesurée pour chaque pic de masse enregistré alors que le pouvoir résolutif correspond à un paramétrage de l’instrument. Il donne une idée de la résolution réellement atteinte mais sur la plupart des analyseurs la résolution réelle varie avec le rapport m/z du pic de masse étudié.

La précision de mesure de masse correspond à la capacité de l’analyseur à mesurer avec justesse la masse de l’ion. Elle s’exprime généralement sous la forme d’une erreur entre la masse

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mesurée et la masse théorique et peut soit être donnée en dalton soit en partie par million (ppm). Cette dernière définition est généralement retenue pour les analyseurs à haute résolution.

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La précision de mesure de masse sera un des éléments déterminant lors de l’analyse métabolomique, notamment dans l’identification des signaux d’intérêt.

Enfin, la vitesse d’acquisition correspond au temps nécessaire à l’enregistrement d’un spectre de masse. Elle s’exprime soit sous forme d’une fréquence (x spectres par seconde ou x Hertz) soit sous forme d’un temps d’acquisition en millisecondes. La vitesse d’acquisition est un élément important à prendre en compte, notamment lors d’analyse par couplage LC-MS. En effet, pour ce type d’analyse, le temps disponible pour enregistrer le signal d’un ion est déterminé par la largeur du pic chromatographique. La vitesse d’acquisition doit donc être adaptée au système chromatographique utilisé.

Le fonctionnement de chaque type d’instrument est détaillé en Annexe 2 mais chacun présente ses avantages et ses inconvénients. Le Tableau 2 présente les performances maximales atteintes par chacun des types d’analyseur. Les analyseurs à temps de vol sont les moins résolutifs mais présentent la plus haute vitesse d’acquisition ce qui a permis de développer de nouvelles approches d’acquisition (voire Paragraphe 4). A l’opposé, les FT-ICR nécessitent plus de temps pour enregistrer un spectre mais ils permettent d’atteindre la plus haute résolution et la meilleure précision de mesure de masse. Les Orbitrap présentent des caractéristiques (résolution, précision de mesure de masse, vitesse d’acquisition, coût) intermédiaires parmi les analyseurs à haute résolution. Bien que relativement récents, ils tendent donc à être de plus en plus utilisés pour les analyses métabolomiques. De par sa position centrale et son utilisation grandissante, c’est cette technologie qui sera utilisée tout au long de ce travail de thèse.

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Pouvoir Résolutif ^{Erreur de mesure}

de masse (ppm) ^{Vitesse d’acquisition Cout}

Temps de Vol Jusqu'à

50 000 @ m/z 950 < 1 30 Hz à PR 50 000 100 Hz à PR 35 000 ⁺ Orbitrap Jusqu'à 1 000 000 @m/z 200 < 1 0.5 Hz à PR 1 000 000 40 Hz à PR 7 500 ⁺⁺ FT-ICR Jusqu’à 20 000 000 < 0.25 1 Hz à PR 1 200 000 3 Hz à PR 150 000 ⁺⁺⁺

Tableau 2 : Résumé des performances de différents types d’analyseur (“Orbitrap FusionTM LumosTM TribridTM

Mass Spectrometer,” 2018, “scimaX MRMS - Taking science to the max - Identification with confidence,” 2018, “Spectrométrie de masse haute définition SYNAPT G2-Si : Waters,” 2018)

Les spectromètres de masse modernes sont souvent composés de plusieurs types d’analyseurs. En générale, il s’agit d’un analyseur à basse résolution (souvent un quadripôle) couplé en série à un analyseur à haute résolution. Les analyseurs à basse résolution sont présentés en Annexe 2. Ce type de construction va permettre d’acquérir des données de profilage mais également des données de spectrométrie de masse en tandem. Cela consiste en la sélection et la fragmentation d’un nombre réduit d’ions dont les fragments seront analysés. Certains instruments dit « tribride » combinent même trois analyseurs différents en série ou en parallèle et donnent une flexibilité encore plus importante dans les types d’acquisition disponibles (Senko et al., 2013).