Western blot
Numa primeira fase, as células das linhas MDA-MB-231 STn+ e MCR STn+ foram lisadas e quantificadas quanto ao seu teor proteico. Os valores de quantificação obtidos foram de 14,85 µg/µL para a linha MDA-MB-231 STn+ e de 7,4 µg/µL para a linha MCR STn+.
De seguida, foi feito um gel de poliacrilamida a 12% (Fig 3.9 a) onde se colocou 60 µg de lisado proteico de cada linha por poço. A membrana foi marcada com o soro (1:50) e, após revelação da membrana num filme por quimioluminescência, foi possível observar o padrão de bandas das proteínas que foram reconhecidas pelo soro do murganho imunizado com OSM. A marcação pareceu ser semelhante para as duas linhas, com bandas na zona de massa molecular igual ou superior 50 kDa, embora mais intensa no caso da linha MDA-MB-231 STn+ possivelmente devido à maior expressão de STn que esta apresenta.
Figura 3.9- Análise por Western blot das proteínas STn+ presentes nos lisados proteicos da linha celular MDA- MB-231 STn+ e da linha MCR STn+ (a), e lisados proteicos da linha MCR STn+ tratada (T) ou não (NT) com sialidase (b), com marcação com o soro do murganho imunizado com OSM.
De forma a corroborar os resultados obtidos por citometria de fluxo, foi estudada a especificidade dos anticorpos presentes no soro contra o lisado proteico das linhas MDA-MB-231 STn+ e MCR STn+, as quais tinham sido previamente tratadas ou não com sialidase, por Western blot. Para isso, procedeu- se à lise das células e posterior quantificação de proteína, cujos valores foram de 3 µg/µL para a linha MDA-MB-231 STn+ tratada e não tratada e de 1 µg/µL para a linha MCR STn+ tratada e não tratada. Foi feito um gel de poliacrilamida a 8%, possibilitando uma maior migração das proteínas comparativamente ao gel a 12%, resultando numa melhor separação das proteínas com mais 50 kDa, onde foram aplicados aproximadamente 45 µg de cada lisado proteico, tratado ou não enzimaticamente. Após marcação com o soro, foi possível observar, embora com um pouco de
background, a diferença no padrão de bandas presente na linha MCR STn+ tratada ou não com sialidase (Fig 3.9 b), principalmente na zona de massa molecular correspondente aos 100 kDa. Relativamente à marcação do soro contra a linha MDA-MB-231 STn+ (Fig 3.10), não foi muito notória a diferença entre as células tratadas ou não enzimaticamente, tendo a marcação no geral sido considerada fraca. Por isso, com a mesma membrana procedeu-se a uma segunda marcação com o controlo positivo de marcação TKH2, onde foi possível observar uma marcação positiva forte e bastante distinta entre as células tratadas ou não com sialidase. Duas bandas muito evidentes presentes na marcação das células que não sofreram tratamento enzimático, uma entre os 50 e os 75 kDa e outra entre os 75 e os 100 kDa, desapareceram na marcação das células tratadas com a enzima.
Figura 3.10- Análise por Western blot das proteínas STn+ presentes nos lisados proteicos da linha celular MDA- MB-231 STn+ tratada (T) ou não (NT) com sialidase. Primeira marcação com o soro do murganho imunizado com OSM e segunda marcação com o controlo positivo de marcação anti-STn TKH2.
Com o intuito de complementar o estudo sobre a especificidade do soro do murganho imunizado com OSM, foi analisado o padrão de marcação do soro contra duas amostras STn+, a quimera MUC1-STn e a amostra de origem animal BSM (Fig 3.11). Foi feito um gel de poliacrilamida a 8% onde foi
aplicado 5 µg de MUC1-STn e 10 µg de BSM, na condição de tratamento ou não com sialidase. Verificou-se que o soro reconheceu a estrutura de MUC1-STn, constituída pela glicoproteína MUC1 humana que apresenta uma elevada massa molecular na gama dos 135-250 kDa, e reconheceu o glicano STn uma vez que se observou uma redução bastante evidente da marcação da amostra tratada com sialidase. É de realçar o facto de o soro ter marcado de uma forma semelhante a amostra MUC1-STn ao TKH2. Relativamente à marcação do soro contra BSM, observou-se uma forte marcação que pode ser explicada pelo facto da amostra BSM ser constituída por mucinas animais e, pelo facto do soro obtido de uma amostra de sangue do murganho imunizado com OSM, o qual também é constituído por mucinas animais, possivelmente conter anticorpos contra mucinas deste tipo que podem estar também a reconhecer a BSM.
Com base nestes ensaios, foi também perceptível a eficácia do tratamento com sialidase na quimera MUC1-STn, constituída por uma única proteína, em detrimento dos lisados celulares tumorais.
Figura 3.11- Análise por Western blot das proteínas STn+ presentes na amostra MUC1-STn, tratada (T) ou não (NT) com sialidase, e marcada com o controlo positivo de marcação TKH2. Análise das amostras MUC1-STn e BSM, ambas tratadas ou não enzimaticamente, marcadas com o soro do murganho imunizado com OSM.
Em suma, a análise do soro do murganho imunizado com OSM sugeriu a presença de anticorpos que reconheciam a quimera MUC1-STn, a amostra BSM e os lisados proteicos das linhas MDA-MB-231 STn+ e MCR STn+. Como o padrão de todas as marcações foi reduzido com o tratamento com sialidase, os anticorpos presentes no soro reconhecem estruturas sialiladas, possivelmente STn. É importante referir que, como esperado, na marcação de MUC1-STn (estrutura com um elevado teor em STn) com o anticorpo THK2 foi notória a diferença entre a marcação da quimera tratada ou não com sialidase. Como esta diferença na marcação também se verificou quando se utilizou o soro para marcar a mesma amostra, existe assim uma forte indicação que o murganho imunizado com OSM estava a produzir anticorpos contra STn.