Modulation de l’expression de gènes impliqués dans l’autophagie par les

Comme il a été vu précédemment, l’autophagie peut être divisée en plusieurs étapes : l’initiation du processus conduisant à la formation de l’autophagosome, son élongation, puis la fusion de ce dernier avec le lysosome pour former l’autolysosome dans lequel s’effectue la dégradation du contenu de l’autophagosome. Plus de 30 gènes sont impliqués dans la régulation de ce processus. Afin de compléter les résultats de notre article, nous avons examiné l’expression de certains de ces gènes en réponse à l’exposition aux particules.

4.3.1.1. Formation - élongation de l’autophagosome

Dans l’article, nous n’avions pas observé de changements de l’expression du conjugué Atg5-Atg12, impliqué dans l’élongation de l’autophagosome. Afin de confirmer que les particules étudiées ici n’intervenaient pas dans cette étape d’élongation, nous avons quantifié l’expression du gène codant pour la protéine Atg4, impliquée dans la maturation de la protéine LC3, nécessaire à la formation et à l’élongation de l’autophagosome. Aucune modification significative de l’expression du gène Atg4 n’a été observée après exposition des macrophages aux particules par rapport au contrôle (Figure 20a). De plus, l’expression du gène LC3, codant pour la protéine précurseur de LC3, est modulée de façon différente selon les particules (Figure 20b). Les nanotubes de carbone non fonctionnalisés (S-CNT et L-CNT) induisent une diminution significative de l’expression génique de LC3 alors que l’exposition aux mêmes nanotubes fonctionnalisés ne modifie pas l’expression de ce gène. L’exposition des macrophages à FW2 et aux particules de TiO₂ induit une légère augmentation de l’expression génique de LC3, significative pour A10, Rut, P25 – Au3 et P25 – Au6.

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4.3.1.2. Fusion autophagosome - lysosome

Après leur formation dans le cytoplasme, les autophagosomes fusionnent ensuite avec les lysosomes pour former les autolysosomes. Cette étape de fusion nécessite un transport correct des autophagosomes vers les lysosomes, notamment effectué via le réseau du cytosquelette. Dans notre article, nous n’avons pas observé de perturbation du réseau de microtubules, indiquant une absence de transport des structures et donc une absence de fusion entre celles-ci. Afin de mieux analyser l’étape de fusion de l’autophagosome et du lysosome, l’expression génique de plusieurs protéines (Stx17, SNAP29 et VAMP8) impliquées dans cette étape a été déterminée. Ces protéines sont des protéines de la famille des SNARE jouant un rôle dans la fusion membranaire ; Stx17 est recrutée par les autophagosomes et interagit avec la protéine cytosolique SNAP29, qui elle-même interagit avec VAMP8, localisée sur la membrane lysosomale. Cette interaction permet la réalisation de la fusion entre autophagosome et lysosome (Shen and Mizushima 2014). Aucune modification majeure de l’expression génique de ces trois protéines n’a été observée en réponse à nos particules. Nous avons cependant observé une diminution significative de l’expression de Stx 17 en réponse aux CNT non fonctionnalisés, associée à une augmentation de l’expression de SNAP29

Figure 20 : Expression de gènes impliqués dans la formation et l’élongation de l’autophagosome

Quantification des gènes Atg4 (a) et LC3 (b) dans des macrophages murins exposés à 50 µg/ml de particules pendant 6h. * : p < 0,05 comparé au contrôle.

145 (Figure 21). Ces résultats pourraient suggérer un défaut de fusion entre l’autophagosome et le lysosome en réponse à ces deux particules.

Figure 21 : Expression de gènes impliqués dans l’étape de fusion autophagosome-lysosome

Quantification des gènes codant pour Stx17 (a), SNAP29 (b) et VAMP8 (c) dans des macrophages murins exposés à 50 µg/ml de particules pendant 6h. * : p < 0,05 comparé au contrôle.

4.3.1.3. Fonction et biogenèse du lysosome

Nous nous sommes ensuite intéressés à la fonction du lysosome. Nous avons montré dans l’article que les CNT induisaient une augmentation de l’expression de LAMP1 et de LAMP2, protéines constituantes de la membrane lysosomale. Celle-ci était associée à une augmentation de l’expression d’une enzyme lysosomale, la cathepsine B. Cependant, dans les macrophages traités avec FW2 ou avec les particules de TiO2, nous n’observions pas de modulation (ou très peu) de l’expression de ces protéines lysosomales. Afin de vérifier, si l’augmentation protéique était liée à une transciption génique augmentée, nous avons également vérifié l’expression des gènes codant pour ces protéines et n’avons observé aucun changement significatif dans les cellules traitées aux particules par rapport au contrôle (Figure 22). Nous avons également mesuré l’activité des cathepsines totales et n’avons observé aucune différence de l’activité de ces enzymes dans les macrophages traités à nos particules.

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Figure 22 : Expression de gènes lysosomaux

Quantification des gènes codant pour LAMP1 (a), LAMP2 (b) et cathepsine B (c) dans des macrophages murins exposés à 50 µg/ml de particules pendant 6h.

Figure 23 : Activité des cathepsines

Mesure de l’activité des cathepsines dans des macrophages murins exposés à 50 µg/ml de particules pendant 6h. * : p < 0,05 comparé au contrôle

L’expression du gène TFEB, un facteur de transcription, a également été quantifiée en réponse à une exposition aux particules. TFEB est connu pour moduler l’autophagie, notamment en régulant la biogenèse des lysosomes, via son contrôle transcriptionnel de gènes codant pour des protéines associées à la membrane du lysosome ou encore codant pour des enzymes lysosomales. Le facteur de transcription TFEB est également connu pour réguler l’expression de certains gènes Atg (Shen and Mizushima 2014). L’expression du gène TFEB a été quantifiée dans les macrophages exposés aux particules et une diminution significative de la transcription de ce gène a été relevée seulement dans le cas des cellules traitées avec les

147 CNT non fonctionnalisés (Figure 24). Ces résultats suggèrent un défaut de la biogenèse lysosomale en réponse à ces particules, cependant ces données n’étant basées que sur l’expression génique, il faudrait confirmer ces résultats en analysant également l’expression de la protéine TFEB.

Figure 24 : Expression de TFEB

Quantification du gène TFEB dans des macrophages murins exposés à 50 µg/ml de particules pendant 6h.