Modélisation de la structure du tandem de domaines BRCT de Nbs1

La partie du travail effectuée par Vincent Meyer a permis de détecter sans ambiguïté la présence de domaines BRCT très divergents au sein de Nbs1 et Xrs2. L’objectif suivant pour notre équipe était de produire expérimentalement ces domaines pour étudier leurs propriétés fonctionnelles. Toutefois, du fait de la très forte divergence de certaines régions de l’alignement, il subsistait un doute sur la délimitation exacte de l’extrémité C-terminale du tandem BRCT. Comme nous l’avons dit précédemment, la zone de 250 résidus qui suit immédiatement le domaine FHA et qui contient le tandem BRCT est très peu conservée (10% d’identité de séquence). Afin d’identifier le plus précisément possible les délimitations de ces domaines, j’ai effectué une étude approfondie s’appuyant sur la modélisation structurale du tandem. Cette étude a impliqué une exploration manuelle de nombreux alignements alternatifs et une évaluation des modèles structuraux correspondants par des potentiels statistiques et par des simulations de dynamique moléculaire. Cette approche itérative assez fastidieuse nous a néanmoins permis d’éliminer de nombreux alignements a priori possibles sur la base des alignements de séquences mais incompatibles dans le contexte de la structure tridimensionnelle.

En nous servant de l'alignement de séquence proposé directement par la comparaison HMM-HMM et ayant permis d'identifier le tandem de domaines BRCT, les premiers modèles du tandem domaines BRCT de Nbs1 ont été produits avec MODELLER8V2 (Sali and Blundell, 1993). L’évaluation de ces modèles par les potentiels statistiques VERIFY3D (Luthy et al., 1992), PROSA2003 (Sippl, 1993), PROQ et MAXSUB (Wallner and Elofsson, 2003) a révélé que plusieurs régions étaient probablement mal alignées et conduisaient à des structures peu probables. Pour VERIFY3D et PROSA2003, ses scores respectivement supérieurs à 0,1 et négatif permettent généralement de valider la fiabilité d’un modèle. Un score PROQ>1,5 couplé à un score MAXSUB>0,1 est un gage supplémentaire de fiabilité de la structure évaluée (Wallner and Elofsson, 2003). Les problèmes se concentraient dans la région C-terminale et plus particulièrement au niveau de la dernière hélice α (données non exposées). L’alignement initial a donc été raffiné par une exploration manuelle des différentes combinaisons possibles. Cette exploration centrée principalement sur la région C-terminale a conduit à un ensemble de dix alignements acceptables au vu des scores d’évaluation par les potentiels statistiques et relativement similaires les uns des autres.

Pour discriminer entre ces solutions, différentes simulations de dynamique moléculaire en solvant explicite ont été calculées en utilisant le programme GROMACS 3.2 et le champ de force OPLS (Van Der Spoel et al., 2005). Après avoir placé les modèles dans une boîte d’eau et introduit des ions pour neutraliser le système, une minimisation a été effectuée. La température du système a ensuite été progressivement amenée à 300K par un recuit simulé avant qu’une simulation de dynamique moléculaire de 5 nanosecondes ne débute. Pour la plupart des modèles, un dépliement progressif de la région C-terminale a été observé après les deux premières nanosecondes de simulation. L’origine du dépliement était de deux ordres : (i) longueurs des segments connectant les structures secondaires trop courtes et induisant des contraintes trop fortes sur la topologie du domaine (ii) existence de cavités qui ne pouvaient être compensées par la relaxation de la structure au cours de la simulation.

figure 21 : Alignement multiple des séquences du tandem BRCT de Nbs1, Xrs2, et d’autres séquences de tandems BRCT parmi lesquelles on trouve trois structures connues (1Kzy, 2Ado, 1L0b). Sur la ligne du bas est représentée la position des structures secondaires : les hélices en rouge et les brins en vert. La ligne du haut indique les délimitations du domaine BRCT1 et du domaine BRCT2. Les positions en contact avec le résidu pS dans les structures connues sont indiquées par des triangles rouges (le contact se fait via la chaîne latérale), et des triangles blancs (le contact se fait via le squelette). Les boîtes rouges et vertes encadrant les noms de séquences regroupent celles-ci en fonction du motif sur ces positions. Enfin, les positions en contact avec le résidu pS+3 sont indiquées par des cercles verts et celles en contact avec le reste du peptide par des cercles jaunes.

figure 22 : Modèle de la structure du tandem de domaines BRCT de Nbs1. Ce modèle a été produit par modélisation comparative via Modeller8v2 (Sali and Blundell, 1993) d’après les structures de références 2Ado et 1T15. La structure du tandem BRCT avant dynamique (en ruban, couleur arc-en-ciel), est superposée à celle après la simulation de dynamique moléculaire de 5ns (en ruban, gris). Le site connu pour reconnaître des phospho-sérines dans les autres tandems BRCT est indiqué (phospho-sérine en sphères, le peptide en bâtons).

figure 23 : Stabilité des structures secondaires, calculées par DSSP (Kabsch et al., 1983), au cours des 5ns de simulation de dynamique moléculaire en solvant explicite. Les positions sont en ordonnée et le temps, en ps, en abscisse. Les premières 500ps (bande blanche) sont consacrées au recuit simulé ayant permis de chauffer le système de 0K à 300K. Les hélices α sont représentées par des points bleus, les brins β par des points rouges.

Pour un des alignements sélectionnés représenté dans la figure 21, nous avons observé que les structures secondaires de Nbs1 étaient toutes stables au cours de la dynamique (figure

23). Le modèle initial du tandem de domaines BRCT de Nbs1 ainsi que la structure obtenue

après 5 ns de simulation sont superposés sur la figure 22. En s’appuyant sur cette solution d’alignement, un modèle du domaine de Xrs2 a également été généré et validé par les potentiels statistiques et par dynamique moléculaire. Les scores statistiques pour le modèle de Nbs1 sont (PROSA2003: –1,92),(VERIFY3D: 0,395), (PROQ : 3,51) et (MAXSUB : 0,348) et ceux du modèle de Xrs2 sont (PROSA2003 : –1,16), (VERIFY3D : 0,332), (PROQ :3,75) and (MAXSUB : 0,338). La figure 24 illustre les scores obtenus avec le potentiel VERIFY3D pour les deux modèles Xrs2 et Nbs1 le long de la séquence.

figure 24 : Evaluation des deux modèles de tandem BRCT de Nbs1 (en rouge) et Xrs2 (en noir) par le potentiel statistique VERIFY3D. Le score résidu par résidu est représenté en ordonnée tandis que la séquence est en abscisse.